即用型比例發光免疫傳感器檢測辣椒中的赭曲霉毒素A
食品中霉菌毒素的污染是一個嚴重的全球性問題。其中,赭曲霉毒素A (Ochratoxin A, OTA)是最毒性最高、分布最廣的真菌毒素之一。OTA在人畜中可引起各種不良健康影響,并對全球經濟和國際貿易造成損害。因此,通過有效的檢測方法監測食品和原料中OTA的含量對于確保食品安全至關重要。
目前用于OTA檢測的傳統方法，如高效液相色譜(HPLC)、液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)和氣相色譜-質譜(GC-MS)等,存在儀器昂貴、樣品前處理復雜、檢測過程時間長以及受基質干擾等缺點。免疫分析法作為一種快速檢測OTA的有力工具,由于其靈敏度高、操作簡便等優點而備受關注。但傳統免疫分析法依賴于人工合成的毒素類似物作為競爭性抗原,存在合成路徑復雜、批次誤差大以及環境污染等問題。近年來，許多研究報道了利用模擬肽和抗獨特型抗體等替代品來取代人工合成的抗原用于免疫分析，但大多數仍與單克隆抗體結合。
本研究以OTA特異性單域抗體Nb28和其特異性結合的模擬肽Y4為基礎,設計了一種基于比色學比率的生物發光免疫傳感器(RBL-免疫傳感器),用于快速、便攜、靈敏的OTA檢測。該傳感器由三個組分組成:Nb28-大片段納米發光素(NLg)、多價Y4-小片段納米發光素(MPSm)和綠色增強納米光子(GeNL)。NLg與MPSm的特異性結合會引起納米發光素的重組,產生藍光發射;而GeNL能通過生物發光共振能量轉移(BRET)產生綠光發射。OTA的濃度變化可通過微孔板讀數機測量的發射峰強度比(λ458/λ518)以及智能手機拍攝的圖像的藍/綠通道比值進行定量檢測。與單一信號的傳感器相比,該RBL-免疫傳感器顯示出更穩定的檢測性能,不受外部因素的影響。
結果與討論
1 標記蛋白的表達與純化
將編碼MPSm和GeNL的重組表達載體pET25b-MPSm和pET25b-GeNL轉化至大腸桿菌BL21(DE3)菌株,經誘導表達并利用Ni-NTA親和層析柱純化得到目標蛋白。SDS-PAGE分析結果顯示,經純化的NLg、MPSm和GeNL在還原條件下均呈現單一條帶,分子量分別約為35.5 kDa、11.8 kDa和47.7 kDa,與預期一致。其中,MPSm作為一種七聚體結構的融合蛋白,在非還原條件下呈現約82.6 kDa的條帶。
2. 傳感器的工作機理驗證
進一步驗證了MPSm作為Nb28的識別元件,以及NLg-MPSm結合是否能夠誘導納米發光素的重組并產生發光信號。結果表明,在沒有OTA存在時,"NLg+MPSm"傳感器可產生約460 nm的明顯發光峰;而加入100 ng/mL OTA后,峰值信號消失,證實了MPSm與NLg之間的特異性競爭性結合。此外,引入校準酶GeNL作為內參后,"NLg+MPSm+GeNL"傳感器在無OTA存在時可同時觀察到約460 nm和520 nm的兩個明顯發光峰;而加入100 ng/mL OTA后,460 nm處的發光峰顯著降低。這進一步驗證了上述設計推測的反應過程。
通過SPR動力學測試,NLg和MPSm的平衡解離常數KD為1.25 μM,遠高于Lg和Sm的內在親和力(KD=190 μM),表明二者之間具有更強的相互作用。與單一發光信號的傳感器相比,引入GeNL后的RBL-免疫傳感器在持續時間內保持了穩定的發光信號比值,不受基質消耗的影響。這歸因于納米發光素和校準酶GeNL同時催化底物而產生的雙信號變化是同步的,因此信號比值變化更加穩定持久。
3. RBL-免疫傳感器的優化
為獲得RBL-免疫傳感器對OTA的最佳檢測性能,優化了NLg、MPSm和GeNL的濃度等關鍵參數。首先通過發光成像技術,確定了NLg和MPSm的最佳濃度比,以實現免疫傳感器的可視化檢測。在此基礎上,進一步采用校正曲線法優化了GeNL的濃度。結果顯示,當NLg、MPSm和GeNL的質量濃度分別為0.5 μM、0.25 μM和0.125 μM時,免疫傳感器表現出最佳的發光信號和檢測靈敏度。
4. RBL-免疫傳感器的性能評估
在優化的實驗條件下,利用微孔板讀數機和智能手機分別對免疫傳感器的檢測性能進行了評估。微孔板讀數機測定結果顯示,傳感器的檢測限(LOD)為0.98 ng/mL,動態檢測范圍為1.56-1000 ng/mL;而基于智能手機圖像分析的檢測限為1.89 ng/mL,動態范圍為3.13-1000 ng/mL。兩種檢測方式下的標準曲線擬合良好,表明該免疫傳感器具有優異的檢測性能。
為評價傳感器的選擇性,除OTA外還考察了6種其他常見真菌毒素(OTB、OTC、AFB1、DON、ZEN和FB1)對其的交叉反應性。結果表明,所有其他毒素的半數抑制濃度(IC50)遠高于OTA,表明該傳感器具有良好的選擇性。此外,通過回收實驗驗證了傳感器在黑胡椒和白胡椒樣品中的準確性,回收率在85.2%-115.3%之間,滿足相關標準要求。
最后,該RBL-免疫傳感器還成功應用于10種商品胡椒粉樣品中OTA含量的檢測,并與HPLC分析結果進行了對比驗證。兩種方法測定結果吻合良好,進一步證實了該傳感器作為一種快速、靈敏、可靠的OTA檢測工具的潛力。
結論：本研究以OTA特異性單域抗體Nb28和其結合的模擬肽Y4為基礎,設計并開發了一種基于比色學比率的生物發光免疫傳感器,實現了OTA的快速、便攜和可視化檢測。該傳感器由NLg、MPSm和GeNL三個組分組成,通過NLg與MPSm的特異性結合誘導納米發光素重組,產生藍光發射;同時GeNL能通過BRET產生綠光發射。OTA的濃度變化可通過微孔板讀數機測量的發射峰強度比(λ458/λ518)以及智能手機拍攝的圖像的藍/綠通道比值進行定量檢測。與單一信號檢測相比,該RBL-免疫傳感器表現出更穩定的檢測性能,不受外部因素的干擾。優化后的傳感器在微孔板讀數機和智能手機上分別具有0.98 ng/mL和1.89 ng/mL的檢測限,并顯示出良好的選擇性和準確性。該傳感器成功應用于商品胡椒粉樣品中OTA的快速檢測,為食品安全監控提供了一種新的可靠工具。該工作為設計基于納米抗體和模擬肽的便攜式生物發光免疫傳感器提供了新思路,具有廣泛的應用前景。
參考文獻：Xie, X.; Yang, X.; Zhang, Y.; Mao, F.; He, Z.; Sun, Z.; Zhang, S.; Liu, X., Ready-to-use ratiometric bioluminescence immunosensor for detection of ochratoxin a in pepper. Biosens. Bioelectron. 2024, 259, 116401.
