一種用于同時檢測單核細胞增生李斯特菌和沙門氏菌活菌的qPCR技術
單核細胞增生李斯特菌和沙門氏菌是奶制品中引起食源性疾病的常見病原體。快速和準確的檢測對于有效控制其感染至關重要。然而沙門氏菌等傳統檢測靶標在特異性和敏感性方面存在不足，可能導致假陽性或假陰性結果。qPCR技術無法區分來自非活細胞和活細胞的DNA擴增，因此可能因非活細胞或受損細胞中的DNA泄漏而導致假陽性結果。盡管PMA可以選擇性地與非活細胞的DNA結合并抑制其擴增，但Rey等人的研究表明，單獨的PMA處理可能無法完全抑制非活細胞的DNA擴增，特別是在細胞碎片存在的情況下。
作者在研究中采用了多種方法來提高同時檢測牛奶中單核細胞增生李斯特菌和沙門氏菌活菌的效率和準確性。作者制備了直徑為20納米的金納米顆粒（AuNPs），并評估了其對qPCR系統熒光信號的增強效果。將AuNPs應用于雙重qPCR系統，發現其能夠顯著提高系統的熒光信號強度，進而提高了檢測的靈敏度。其次使用生物信息學方法篩選針對L. monocytogenes（AX10_RS05385）和Salmonella（SEEP-A511_RS03120）的高度特異性引物，將篩選出的特異性引物組合，構建一個能夠同時檢測L. monocytogenes和Salmonella的雙重qPCR系統。探索雙重qPCR中的最佳引物對比例（3:1），以平衡兩個擴增反應。之后引入丙酸丙酯（PMA）作為活細胞DNA選擇性染料，以區分活細胞和非活細胞的DNA。探索并確定了最佳的PMA處理條件，包括PMA濃度（20μM）、孵育時間（8分鐘）和曝光時間（5分鐘），以最大程度地抑制非活細胞的DNA擴增。在PMA處理前，使用0.01%的十二烷基硫酸鈉（SD）進一步增強對非活細胞DNA擴增的抑制效果，使檢測更加準確。利用金納米顆粒（AuNPs）增強qPCR的檢測信號，從而提高檢測系統的靈敏度。
作者又對DNA提取、qPCR反應條件進行了優化。采用熱裂解法代替傳統DNA提取試劑盒進行DNA提取，該方法僅需15分鐘，且更適合現場檢測。使用兩步擴增法優化qPCR反應條件，兩個步驟同時在60℃進行，以減少循環中溫度升降過程所需的時間。通過這些方法和策略，作者成功地開發出了一種靈敏度高、特異性好、檢測時間短的雙重qPCR系統，該系統能夠同時檢測牛奶中的L. monocytogenes和Salmonella活菌。這不僅提高了檢測的準確性和效率，還為食品安全檢測提供了一種有力的工具。
在人工污染的牛奶中進行AuNPs-SD-PMA-qPCR檢測，驗證該方法的準確性、靈敏度和特異性。比較不同方法（如qPCR、PMA-qPCR和AuNPs-SD-PMA-qPCR）在檢測活菌和非活菌方面的差異。并且通過對一系列不同濃度的活菌樣品進行檢測，評估了AuNPs-SD-PMA-qPCR方法的靈敏度。實驗結果表明，該方法能夠準確檢測到低至5×101CFU/g的活菌。通過與常見食品致病菌如大腸桿菌（E. coli）和檸檬酸桿菌（Citrobacter spp.）等進行交叉檢測，驗證了該方法的特異性。通過標準培養方法對檢測結果進行驗證，確認了AuNPs-SD-PMA-qPCR方法在實際樣品檢測中的準確性和可靠性。
綜上所述，作者通過一系列精心設計的實驗，成功地開發并優化了一種快速、高特異性和高敏感性的方法，用于同時檢測牛奶產品中的L. monocytogenes和Salmonella活菌。
圖1所示。(A)引物AX10_RS05385和SEEPA511_RS03120 qPCR擴增曲線。(B) qPCR檢測引物AX10_RS05385和SEEPA511_RS03120的熔化曲線。(C) AX10_RS05385:SEEPA511_RS03120不同引物比例的擴增曲線。(D) AX10_RS05385:SEEPA511_RS03120不同引物配比的熔化曲線。
圖2所示。PMA處理的優化。不同濃度PMA對L. monocytogenes(A)和Salmonella (B)的影響;不同孵育時間對L. monocytogenes (C)和Salmonella (D) 的影響;不同暴露時間對L. monocytogenes(E)和 Salmonella (F)的影響。不同的小寫字母表示非活細胞組間擴增結果(Ct值)有顯著差異(p < 0.05)，不同的大寫字母表示活細胞組間擴增結果(Ct值)有顯著差異(p < 0.05)。
圖3所示。不同SD濃度對L. monocytogenes(A)和Salmonella (B)的影響。(C) AuNPs、AgNPs、PEI@Fe3O4和銀納米線對SD- pma - qpcr系統ΔRn值的影響。(D) AuNPs- SD-PMA-qPCR和SD-PMA-qPCR的擴增曲線。不同小寫字母表示不同非活細胞組間擴增結果(Ct值)差異顯著(p < 0.05)，不同大寫字母表示不同活細胞組間擴增結果(Ct值)差異顯著(p < 0.05)。
圖4所示。應用AuNPs-SD-PMA-qPCR、PMA-qPCR和qPCR技術鑒別L. monocytogenes(A)和Salmonella (B)的活/非活細胞。(C) AuNPs-SD-PMA-qPCR檢測的特異性。(D-E)不同梯度稀釋L. monocytogenes和Salmonella的擴增曲線。(F)不同梯度稀釋的L. monocytogenes和Salmonella的熔化曲線。不同小寫字母表示不同檢測方法擴增結果(Ct值)差異有統計學意義(p < 0.05)。
DOI: 10.1016/j.foodcont.2024.110711
來源：微生物安全與健康網，作者~魏文杰。
