副溶血性弧菌毒力的多重qPCR檢測方案
副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus, Vp)是一種嗜鹽的革蘭氏陰性菌，廣泛分布于世界各地的沿海/海洋水域，被認為是魚類消費中最常見的食物中毒劑。因而，在水產品中監測致病性Vp的存在及水平至關重要。基于此，本研究建立了一種多重實時熒光定量PCR(qPCR)，用于水和食品中的致病性Vp的檢測(tdh/trh1/trh2)，其結果與ISO 21872-1：2007進行比較顯示：tdh/trh1/trh2的檢測限分別為6 CFU/25 g;11 CFU/25g;8 CFU/25 g，且相較于ISO標準方法所需的3天時間(至少)，本研究耗時大大縮短，僅需24 h。
弧菌屬的致病性物種是一個相當大的人類公共衛生威脅，霍亂弧菌、副溶血性弧菌和創傷弧菌是其中最重要的病原體。其中，Vp是一種嗜鹽的革蘭氏陰性菌，在20世紀50年代首次被描述，廣泛分布于世界各地的沿海/海洋水域，常從海產品中分離出來：魚類、甲殼類和軟體類，并被認為是魚類消費中最常見的食物中毒劑。盡管環境和食品樣本中存在副溶血性弧菌，但致病菌株存在率卻很低，僅占總種群的0.3-3%。不過，檢測致病菌株的重要性正在逐年增長。然而，傳統的Vp 致病性鑒定是通過KP實驗實現的，這種致力于檢測TDH毒株，不能檢測TRH毒株，不利于食品安全控制和風險評估。基于PCR的分子檢測方法可以較為輕易地實現毒株的鑒定，其中，qPCR額外引入一個特異性熒光探針(針對引物位點內部的基因特異性序列)，提供了更高程度的特異性。基于此，本研究建立了一種多重qPCR方案，該方法可以實現致病性Vp(tdh和trh)的快速檢測。在一次qPCR反應中，通過使用兩組不同的探針即可檢測tdh、trh1、trh2，這是少數幾個在單一反應中檢測不同形式的trh基因的致病性Vp的研究之一，以往的研究只集中在物種水平上的鑒定。
文章的工作內容可以概括為：1)比較細菌培養基質;2)比較DNA提取方法;3)建立多重qPCR檢測方法并與ISO標準比較。在評估多重qPCR反應體系時，作者引入了一個內部控制對照以評估樣品基質對PCR反應的抑制性，并利用模擬樣本和天然樣本評估了方法的靈敏度，檢測限。總的來說，所開發的qPCR方法不僅達到了傳統微生物方法相同的檢測限，達到了相同的靈敏度(94%)，具有高特異性(100%)，而且明顯縮短了反應時間(24 h)。檢測時間短是至關重要的，因為一些易被細菌污染的產品是新鮮食用的，并不能長時間儲存。不過，研究也有其不足之處，并未將Vp種水平檢測納入其中。
原文DOI：10.1016/j.foodcont.2011.09.015
來源：微生物安全與健康網，作者~鄒晶晶
