如何看懂質粒圖譜——以常用的pcDNA3.1(+)表達載體為例
質粒圖譜的主要構成元件
1.復制起始位點（Ori）
定義：控制質粒復制的起始點。
特點：原核生物DNA分子中通常只有一個復制起始點，而真核生物DNA分子則可能有多個。
作用：決定了質粒的宿主和拷貝數。
識別方法：圖譜上Ori的箭頭指復制方向，一般在大腸桿菌中是pUC類的，還有一種F1啟動子代表的是噬菌體的復制起始方向，只能復制出單鏈的DNA，可以用來測序。
類型判斷：圖譜上只有一個Ori的質粒可能是原核克隆及表達質粒；有兩個Ori的質粒可能是穿梭質粒，既可以在原核也可以在真核中復制。
2.篩選標記
定義：多為抗生素抗性基因，用于檢測盒篩選含有質粒的細胞。
常見類型：AmpR（氨芐青霉素抗性）、Tetr（四環素抗性）、Camr（氯霉素抗性）、Kanr（卡那霉素抗性）、Hygr（潮霉素抗性）等。
作用：方便后續通過抗生素篩選陽性克隆。只在一種宿主中復制的質粒僅具有一種抗性篩選標記，如原核克隆載體和原核表達載體；能夠在兩種類型宿主中復制和表達的載體會具有兩種篩選標記，如穿梭質粒。
3.多克隆位點（MCS）
定義：外源基因的插入位點，為一系列限制性內切酶酶切位點。
特點：每個限制性內切酶位點在整個載體質粒中是唯一的，一般可通過酶切后連接的方式將外源DNA插入質粒。
位置：多克隆位點一般位于轉錄啟動和轉錄終止信號之間。
注意事項：在構建質粒時，需要仔細檢查MCS上的酶切位點，了解哪些酶可以用于切割質粒以插入外源基因。同時，注意酶切位點的排列和位置，以便選擇合適的酶進行切割。
4.其他元件
轉錄調控元件：如啟動子（P）、增強子/沉默子等。啟動子是促進DNA轉錄的DNA順序，常在基因或操縱子編碼順序的上游，是DNA分子上可以與RNA聚合酶（RNApol）特異性結合并使之開始轉錄的部位。增強子為真核基因組（包括真核病毒基因組）中的一種具有增強鄰近基因轉錄過程的調控順序，其作用與增強子所在的位置或方向無關，在所調控基因上游或下游均可發揮作用。沉默子為負增強子，負調控序列。
翻譯調控元件：如核糖體結合位點（Rbs）、起始密碼（AUG）、SD序列（Shine-Dalgarno sequence）等。這些元件對于質粒的表達和調控至關重要。
終止信號：結構基因的最后一個外顯子中有一個AATAAA的保守序列，此位點下游有一段GT或T富豐區，這兩部分共同構成poly（A）加尾信號，可以起到穩定mRNA的作用。
蛋白標簽：通常為較短的短肽，一般通過融合表達的方式連接在目的基因的3’或5’端，常見的標簽包括Flag、Myc、GST、HA和His等。
如何看懂質粒圖譜
1.看Ori的位置：了解質粒的類型（原核/真核/穿梭質粒）。
2.看篩選標記：決定使用什么篩選標記，如抗性。
3.看MCS：決定能不能放目的基因以及如何防止目的基因。
4.看外源DNA插入片段大小：質粒一般只能容納小于1Kb的外源DNA片段。一般來說，外源DNA片段越長，越難插入，越不穩定，轉化效率越低。
5.看表達系統元件：即啟動子-核糖體結合位點-克隆位點-轉錄終止信號，這是用來區別克隆載體與表達載體。克隆載體中加入一些與表達調控有關的元件即成為表達載體。
6.看質粒圖譜上的箭頭：有的箭頭順時針，有的逆時針，代表兩條DNA鏈，即質粒是環狀雙鏈DNA。它的啟動子等在其中一條鏈上，而它的抗性基因在另一條鏈上。
用大家常用的pcDNA3.1(+)表達載體作為案例:
第一步：了解質粒圖譜中的復制起點
如圖譜中(圖一)的ori表示質粒的復制起點。質粒的復制起點決定了質粒的宿主及質粒的拷貝數相關。若圖譜上只有一個ori，表示質粒是原核克隆及表達質粒。而圖譜上有兩個ori，則表示該質粒是穿梭質粒，既可以在原核也可以在真核中復制。
第二步：了解質粒圖譜中的篩選標記
圖譜中(圖二)的AmpR、KanR等表示質粒載體中的篩選標簽，多為抗生素抗性基因，方便后續通過抗生素篩選陽性克隆。只存在單抗性的質粒多為原核克隆載體和原核表達載體。而存在兩種或以上的抗性的多為穿梭質粒。
如何確定質粒的抗性：首先根據質粒的圖譜和序列確定質粒的抗性基因，再確定抗性基因前面是否有啟動子，并且分析該啟動子的適用范圍。
常用真核啟動子有CMV、SV40、EF1a、U6等，原核啟動子有T7、sp6、lac、Amp等。
第三步：了解質粒圖譜中的多克隆位點
圖譜中的MCS區或者許多內切酶集中的部分，就是質粒的多克隆位點。多克隆位點為一系列限制性內切酶酶切位點，是外源DNA的插入位點，一般可通過酶切后連接的方式將外源DNA插入質粒。多克隆位點一般位于轉錄啟動和轉錄終止信號之間。
第四步：了解質粒圖譜中其它元件
質粒載體中除復制起始位點、篩選標記、多克隆位點外，還具有其他一些表達或調控元件，如轉錄調控元件、翻譯調控元件和融合表達標簽蛋白等。
比如：
蛋白純化標簽蛋白：His-Tag，GST-tag等
蛋白檢測標簽蛋白：Myc-Tag，Flag-Tag，HA-Taq等
熒光蛋白表達標簽：GFP，mCherry等。
