重組質粒構建全流程
實驗操作
一、LB培養基配置
LB培養基用于一般細菌培養，特別用于分子生物學試驗中大腸桿菌的保存和培養。其中蛋白胨、酵母膏粉提供氮源、維生素和生長因子，NaCl維持均衡的滲透壓，葡萄糖提供碳源，瓊脂是培養基的凝固劑。
【試劑】
胰蛋白胨（Tryptone）、酵母提取物（Yeast Extract）、NaCl、瓊脂（Agar）
【實驗步驟】
1、LB固體培養基配方（配置100ml培養基）
胰蛋白胨（Tryptone） | 1g |
酵母提取物（Yeast Extract） | 0.5g |
NaCl | 1g |
瓊脂粉（Agar） | 1.5g |
雙蒸水 | 100ml |
蛋白胨很容易吸潮，在稱取時動作要迅速，另外，稱藥品時嚴防藥品混雜，一把藥匙用于一種藥品、或在稱取一種藥品后，洗凈、擦干，再稱取另一種藥品，瓶蓋也不要蓋錯。
2、液體培養基除不加瓊脂粉以外，其余同固體培養基一樣。
3、包扎
用報紙封住瓶口，再用皮筋捆扎好，用記號筆注明培養基名稱、組別、日期。
4、滅菌
將上述培養基以1.05kg/cm2/121.3℃、20min高壓蒸汽滅菌。如因特殊情況不能及時滅菌，則應放入4℃冰箱內暫存。滅菌后，將錐形瓶放入烘箱烘干，烘干后，4℃保存。
5、LB固體培養基倒板
①配置：如上述配方配置100ml的LB固體培養基。
②抗生素的加入（以Amp抗性為例）：將凝固的培養基放入微波爐內加熱至完全融化，然后置于55℃的水浴中，待培養基溫度降至55℃時（手可觸摸）加入100ul Amp抗生素，以免溫度過高導致抗生素失效，并充分搖勻。
③倒板：一般20ml倒1個板子，培養基導入培養皿后，打開蓋子，在紫外下吹15-20min。
④保存：將培養皿倒置放于4℃保存，一個月內使用。
二、PCR獲取目的基因
【試劑】
滅菌水、高保真酶（2×）、引物（上、下）、模板DNA（質粒）
【操作步驟】
加熱前應先打開PCR儀預熱。
1、在0.5ml PCR管中依次加入下列試劑：
①20ul體系：
滅菌水： | 7ul |
高保真酶（2×）： | 10 |
上引物： | 1ul |
下引物： | 1ul |
模板DNA： | 1ul |
總體積： | 20.0ul |
2、將上述PCR反應混合物放入PCR儀中。
3、設定程序進行擴增（以所用高保真酶說明書為準）：
94℃變性5min后，開始以下循環
94℃變性----------------------------------------30s
55℃退火（退火溫度不固定，根據引物進行調整）----1min
72℃延伸-----30s（延伸時間根據目的片段的長度進行調整）
共30個循環
最后循環結束后72℃反應7min，4℃冷卻。
4、PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。
【注】：在PCR小管中加樣時，可先將各試劑加到管壁上，最后混勻。這樣既節省時間，又節省槍頭。
三、PCR產物的回收與純化
1、溶膠：將PCR產物稍微離心片刻，電泳檢測目的條帶，將切好的膠放入干凈的1.5ml EP管中，加330ul溶膠液（沒過膠塊體積的2/3），60度水浴鍋放置30min左右，至其充分溶解（注：切膠時請注意不要將DNA長時間暴露于紫外燈下，以防DNA損傷。）
2、柱平衡：吸附柱裝到收集管中，加100ul的BL，12000rpm離心30s，倒收集管廢液。
3、過柱：將步驟一中的溶膠液倒入吸附柱中，靜置2min，使DNA與吸附柱充分結合，12000rpm離心30s，倒收集管廢液。
4、洗雜：加450ul PW，12000rpm離心30s，倒收集管廢液。
5、重復步驟④。
（步驟②~步驟⑤可以在抽濾機上操作。）
6、空離：12000rpm，2min左右（可以適當多離一會），丟掉收集管，將吸附柱放到新的1.5ml離心管中。開蓋，晾干5~10min，去除殘余乙醇。
7、洗脫：懸空滴加30ul TB，室溫放置2min，12000rpm離心30s。（條帶較淡的可以少加點TB，18-20ul）。
8、貼標：丟掉吸附柱，在管蓋貼上相應標簽，置于-20度冰箱保存。
四、載體酶切反應
【試劑】
Cut Buffer、限制酶I（EcoR I）、限制酶II（BamH I）、重組質粒（plasmind）、滅菌水
【實驗步驟】
1、實驗前水浴準備。
2、在0.5ml的PCR管中加入下列試劑：
體系
滅菌水： | 50-V |
Cut Buffer： | 5ul |
質粒： | 1ug/C |
EcoR I： | 1.5ul |
BamH I： | 1.5ul |
總體積： | 50ul |
【注】：黑色加粗部分的體積不隨總體系體積的變化而變化，即保持恒定不變。
3、37℃反應30min。
4、瓊脂糖凝膠電泳檢測雙酶切產物。
【注】Buffer的選擇：需要參考所選擇的酶，必須同時適用于兩種酶。詳細資料請于所用內切酶官網查詢。
五、重組反應--片段與載體連接（以2片段重組為例）
重組體系（10ul）
2x重組酶 | 5ul |
酶切后載體 | 1ul |
PCR產物1 | 2ul |
PCR產物2 | 2ul |
總體系 | 10ul |
50度連接30分鐘（*按照重組酶說明書進行）。
六、重組產物的轉化
1、轉化
①全量10ul加入至感受態細胞中，冰上放置40min。
②42℃水浴鍋內熱激90s（讓質粒進入感受態細胞）。
③取出冰上放置5min（讓感受態細胞關閉）。
④加入200ul LB無抗液體培養基，37℃搖床培養1h。
2、涂板
將上述培養液涂布在含AMP的LB固體培養基上，過夜培養。
3、挑菌
第二天晚上五點左右挑菌，在5ml LB液體培養基（加5ul AMP）中搖床培養，38℃過夜。（5ml LB培養菌+5ul AMP+用槍頭挑菌，槍頭可打入培養瓶中），供第二天提取質粒。
七、質粒的提取（protocol）
1、大腸桿菌的培養：從平板培養基上挑選單菌落接種至5ml的含有抗生素的LB液體培養基中，37℃過夜培養。
【注：培養液不宜過量，過量時會因菌量太大而溶菌不充分，純化時會影響質粒的純度。】
2、5ml菌液倒入5ml離心管中，10,000xg，1min離心，棄上清。（實驗室用的離心機轉速達不到，故將其調到最大轉速12,000rmp，離心2min）
【注：rmp（轉速）與rcf=xg（相對離心力），RPM只是一個習慣用法，g才是衡量轉速的通用標準；不同的轉子，RPM是不能通用的，g值則是通用的，也就是說，只要你在不同的離心機上用相同的g，他們的離心效果原則上是一樣。】
3、加入250ul Solution I（使用前加入RNase AI，冰箱4℃冷藏），充分懸浮細菌沉淀。
【注：注意不要殘留細小菌塊，可以使用振蕩器Vortex等劇烈振蕩使菌體充分懸浮。】
4、加入250ul Solution II【裂解細胞】（提前放入37℃孵育箱內預熱）輕輕地上下翻轉混合5-6次，使菌體充分裂解，形成透明溶液。
【注：此步驟不宜超過5min。】
5、加入350ul Solution III【變性蛋白】，輕輕上下翻轉混合5-6次，直至形成緊實凝集塊。
6、將上面液體倒入1.5ml的EP管中，13，000xg，10min離心。
7、將上述離心得到的液體倒入柱內，10,000xg，1min離心，棄液體。
8、加入500ul bufferHB，10,000xg，1min離心，棄液體。
9、加入700ul DNA wash buffer（提前加入指定體積的100%乙醇），10,000xg，1min離心，棄液體。（重復一次）
10、空離，13，000xg，2min離心。
11、將離心柱放入1.5mlEP管內，置于孵育箱內3min烘干。
12、加入60ul ddH2O（提前在60℃水浴箱內預熱），60℃搖2min。
13、13,000xg，1min離心，得液體。
14、測濃度。
15、DNA經1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。
【注：提好的質粒需標明時間、名稱等，-20℃保存。】
八、瓊脂糖凝膠電泳
【試劑】
瓊脂糖（Agarose），1xTAE電泳緩沖液，染料（SyBR Safe DNA Gel Stain），DL2000 DNA Marker，10xLoading Buffer
【實驗步驟】
1、配置50ml（大樣）、25ml（小樣），1.5%的瓊脂糖凝膠。
稱取50*1.5%=0.75g瓊脂糖粉末于錐形瓶中，加入50ml 1xTAE緩沖液，染料2ul（邊加染料邊倒TAE緩沖液于裝有瓊脂糖的錐形瓶中），封口。
2、放在微波爐中加熱，沸騰2次，直到看不到油滴，形成均一的溶液。（一般中低檔，5min）
3、插入梳子，倒入制膠槽中。
4、放在抽屜里室溫、避光靜置20min。
5、按下表加樣。
①適用于檢測DNA（小孔）：
Marker（DL2000） | 樣品 | ||
3ul | 質粒（DNA） | 10xLoadingBuffer | lxTAE |
3ul | 1ul | 6ul | |
②適合回收DNA（大孔）：
Marker（DL2000） | 樣品 | ||
6ul | 質粒（DNA） | 10xLoadingBuffer | |
20ul | 2.2ul | ||
6、120V，電泳25min左右。
7、檢測：將凝膠板放入檢測儀中檢測。
新建→選染料（SyBR safe）→選顏色（SyBR Green）→勾除高亮選項→檢測→文本注釋（字體14，顏色白色）→保存
8、驗證抽提質粒濃度及大小是否符合測序標準，送測并將樣品于-20度冰箱保存。
【注】：
1、當加入濃度的樣品量小于5ul時，10xLoadingBuffer均加2ul。
2、電泳的加樣孔寬度小于6mm時，每次取5ul制品電泳便可得到清晰條帶，如果加樣孔增寬，需適當增加Marker制品的加樣量。
3、對DNA電泳而言，瓊脂糖的純度對DNA條帶的清晰度影響很大。
4、進行瓊脂糖凝膠電泳時，瓊脂糖的濃度與DNA片段的分離性能關系密切。瓊脂糖的濃度越大，對短片段的分離性能越好，反之，瓊脂糖濃度越小，越有利于長片段DNA的分離。
5、當電泳后片段需回收時，選用大孔膠，當電泳只起檢測作用時，選用小孔膠。
6、實驗室所用Marker條帶以官網說明書為準。
