乳酸脫氫酶活力測定
目的要求
(1) 了解乳酸脫氫酶活性測定原理。
(2) 學習用比色法測定酶活性的方法。
實驗原理
乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase簡稱LDH，EC.1.1.1.27, L－乳酸：
NAD+氧化還原酶）廣泛存在于生物細胞內，是糖代謝酵解途徑的關鍵酶之一，可催化下列可逆反應。
LDH可溶于水或稀鹽溶液。組織中LDH含量測定方法很多，其中紫外分光光度法更為簡單、快速。鑒于NADH, NAD+ 在340nm及260nm 處有各自的最大吸收峰，因此以NAD+為輔酶的各種脫氫酶類都可通過340nm光吸收值的改變，定量測定酶活力，如蘋果酸脫氫酶、醇脫氫酶、醛脫氫酶、甘油－3－3磷酸脫氫酶等。
本實驗測乳酸脫氫酶活力，是在一定條件下，向含丙酮酸及NADH的溶液中，加入一定量乳酸脫氫酶提取液，觀察NADH在反應過程中340 nm 處光吸收減少值，減少越多，則LDH活力越高。其活力單位定義是：在25℃，pH7.5條件下每分鐘A340下降值為1.0的酶量為1個單位。
試劑和器材
一.試劑
50mmol/L pH6.5磷酸氫二鉀－磷酸二氫鉀緩沖液母液：
A: 50 mmol/L K2HPO4: 稱K2HPO41.74g加蒸餾水溶解后定容至200mL。
B: 50 mmol/LK2HPO4: 稱KH2PO43.40g加蒸餾水溶解后定容至500mL。
取溶液A 31.5mL ＋溶液B 68.5mL, 調節pH至6.5。置4℃冰箱備用。
10mmol/L pH 6.5磷酸氫二鉀－磷酸二氫鉀緩沖液用上述母液稀釋得到。現用現配。
0.2 mol/L pH7.5磷酸氫二鈉－磷酸二氫鈉緩沖液母液：
A: 0.2 mol/L Na2HPO4: 稱Na 2HPO4·12H2O 71.64g加蒸餾水溶解后定容至1000mL。
B: 0.2 mol/L NaH2PO 4: 稱NaH2PO4·2H2O 31.21g加蒸餾水溶解后定容至1000mL。
取溶液A 84 mL ＋溶液B 16 mL, 調節pH至7.5。置4℃冰箱備用。
0.1mol/L pH 7.5磷酸鹽緩沖液, 用上述母液稀釋得到。現用現配。
NADH溶液：稱3.5mg純NADH置試管中，加0.1mol/L pH7.5磷酸緩沖液 1mL搖勻。現用現配。
丙酮酸溶液：稱2.5mg丙酮酸鈉，加0.1mol/L pH7.5磷酸緩沖液29mL, 使其完全溶解。現用現配。
二.材料
兔肉。
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