重組質(zhì)粒怎么連接
質(zhì)粒具有穩(wěn)定可靠和操作簡便的優(yōu)點。
如果要克隆較小的DNA 片段(＜10kb) 且結(jié)構(gòu)簡單，質(zhì)粒要比其它任何載體都要好。在質(zhì)粒載體上進(jìn)行克隆，從原理上說是很簡單的，先用限制性內(nèi)切酶切割質(zhì)粒DNA 和目的DNA 片段，然后體外使兩者相連接，再用所得到重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌，即可完成。
但在實際工作中，如何區(qū)分插入有外源DNA 的重組質(zhì)粒和無插入而自身環(huán)化的載體分子是較為困難的。通過調(diào)整連接反應(yīng)中外源DNA 片段和載體DNA 的濃度比例，可以將載體的自身環(huán)化限制在一定程度之下，也可以進(jìn)一步采取一些特殊的克隆策略，如載體去磷酸化等來最大限度的降低載體的自身環(huán)化，還可以利用遺傳學(xué)手段如α互補現(xiàn)象等來鑒別重組子和非重組子。
外源DNA片段和質(zhì)粒載體的連接反應(yīng)策略有以下幾種：
1.帶有非互補突出端的片段
用兩種不同的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化可以產(chǎn)生帶有非互補的粘性末端，這也是最容易克隆的DNA 片段，一般情況下，常用質(zhì)粒載體均帶有多個不同限制酶的識別序列組成的多克隆位點，因而幾乎總能找到與外源DNA 片段末端匹配的限制酶切位點的載體，從而將外源片段定向地克隆 到載體上。也可在PCR 擴(kuò)增時，在DNA 片段兩端人為加上不同酶切位點以便與載體相連。
2.帶有相同的粘性末端
用相同的酶或同尾酶處理可得到這樣的末端。由于質(zhì)粒載體也必須用同一種酶消化，亦得到同樣的兩個相同粘性末端，因此在連接反應(yīng)中外源片段和質(zhì)粒載體DNA 均可能發(fā)生自身環(huán)化或幾個分子串連形成寡聚物，而且正反兩種連接方向都可能有。所以，必須仔細(xì)調(diào)整連接反應(yīng)中兩種DNA 的濃度，以便使正確的連接產(chǎn)物的數(shù)量達(dá)到最高水平。還可將載體DNA 的5' 磷酸基團(tuán)用堿性磷酸酯酶去掉，最大限度地抑制質(zhì)粒DNA 的自身環(huán)化。帶5' 端磷酸的外源DNA 片段可以有效地與去磷酸化的載體相連，產(chǎn)生一個帶有兩個缺口的開環(huán)分子，在轉(zhuǎn)入E. coli 受體菌后的擴(kuò)增過程中缺口可自動修復(fù)。
3.帶有平末端
是由產(chǎn)生平末端的限制酶或核酸外切酶消化產(chǎn)生，或由DNA 聚合酶補平所致。由于平端的連接效率比粘性末端要低得多，故在其連接反應(yīng)中，T4 DNA 連接酶的濃度和外源DNA 及載體DNA 濃度均要高得多。特殊情況下，外源DNA 分子的末端與所用的載體末端無法相互匹配，則可以在線狀質(zhì)粒載體末端或外源DNA 片段末端接上合適的接頭(linker)或銜接頭(adapter)使其匹配， 也可以有控制的使用E. coliDNA聚合酶Ⅰ的klenow 大片段部分填平3'凹端，使不相匹配的末端轉(zhuǎn)變?yōu)榛パa末端或轉(zhuǎn)為平末端后再進(jìn)行連接。
