反復(fù)凍存對菌株的影響及其應(yīng)對策略
在微生物學(xué)研究、工業(yè)生產(chǎn)及生物技術(shù)領(lǐng)域，菌株的保存是確保實(shí)驗重復(fù)性和生產(chǎn)穩(wěn)定性的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。凍存是常用的菌株保存方法之一，但反復(fù)凍存可能對菌株的活性、遺傳穩(wěn)定性及實(shí)驗結(jié)果的可靠性產(chǎn)生顯著影響。本文將從反復(fù)凍存對菌株的影響出發(fā)，探討其潛在問題，并提出優(yōu)化保存策略，以幫助科研人員和產(chǎn)業(yè)從業(yè)者更好地管理菌株資源。
一、反復(fù)凍存對菌株的負(fù)面影響
1.細(xì)胞損傷
反復(fù)凍存過程中，菌株細(xì)胞會經(jīng)歷多次冷凍和解凍，這一過程對細(xì)胞結(jié)構(gòu)造成直接損傷：
（1）冰晶形成：在冷凍過程中，細(xì)胞內(nèi)外的水分會形成冰晶，這些冰晶可能刺破細(xì)胞膜或細(xì)胞壁，導(dǎo)致細(xì)胞破裂。
（2）滲透壓變化：冷凍和解凍過程中，細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的劇烈變化會導(dǎo)致細(xì)胞脫水或過度吸水，進(jìn)一步破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。
這些損傷會顯著降低菌株的存活率，尤其是對凍存條件敏感的菌株。
2.活性下降
反復(fù)凍存不僅影響菌株的存活率，還會削弱其代謝活性和繁殖能力。
存活率降低：每次凍存和解凍都會導(dǎo)致部分細(xì)胞死亡，反復(fù)操作后，菌株的整體存活率顯著下降。
代謝活性減弱：凍存損傷可能導(dǎo)致菌株的酶活性降低，影響其生長速度和代謝功能。
3.遺傳變異
反復(fù)凍存可能增加菌株的遺傳不穩(wěn)定性：
（1）基因突變：冷凍和解凍過程中的物理和化學(xué)變化可能誘發(fā)基因突變，導(dǎo)致菌株的遺傳特性發(fā)生改變。
（2）表型改變：突變可能影響菌株的生理和代謝特性，例如抗生素抗性、代謝產(chǎn)物合成能力等，進(jìn)而影響實(shí)驗結(jié)果的可靠性。
4.污染風(fēng)險
反復(fù)凍存操作增加了污染的可能性：
（1）操作污染：頻繁的凍存和解凍操作增加了外界微生物污染的風(fēng)險。
（2）交叉污染：不同菌株之間的交叉污染可能導(dǎo)致菌株純度下降，影響實(shí)驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。
5.保存效果下降
反復(fù)凍存會降低菌株的長期保存效果：
（1）穩(wěn)定性降低：菌株的遺傳和表型穩(wěn)定性因反復(fù)凍存而下降，可能導(dǎo)致實(shí)驗結(jié)果不一致。
（2）不適合長期保存：反復(fù)凍存不適合作為長期保存方法，尤其是在需要保持菌株高活性和穩(wěn)定性的情況下。
二、反復(fù)凍存影響的機(jī)制
1.物理損傷
冷凍過程中，冰晶的形成和生長是導(dǎo)致細(xì)胞損傷的主要原因。冰晶會破壞細(xì)胞膜和細(xì)胞器的完整性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物泄漏。
2.化學(xué)損傷
冷凍過程中，細(xì)胞內(nèi)外的溶質(zhì)濃度會發(fā)生變化，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性、酶失活等化學(xué)損傷。
3.氧化應(yīng)激
冷凍和解凍過程中，細(xì)胞內(nèi)的自由基生成增加，導(dǎo)致氧化應(yīng)激，進(jìn)一步損傷細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能。
三、優(yōu)化菌株保存的策略
為了減少反復(fù)凍存對菌株的負(fù)面影響，可以采取以下優(yōu)化策略：
1.減少凍存次數(shù)
分裝保存：將菌株分裝成多管，每次實(shí)驗使用一管，避免反復(fù)凍存同一管菌株。
單次凍存：盡量減少凍存次數(shù)，采用單次凍存并分裝多管的方法。
2.優(yōu)化凍存條件
使用保護(hù)劑：在凍存液中添加甘油、二甲基亞砜（DMSO）等保護(hù)劑，減少冰晶形成和細(xì)胞損傷。
控制降溫速度：采用程序降溫法，緩慢降低溫度，減少冰晶對細(xì)胞的損傷。
3.采用替代保存方法
瓷珠保存法：利用表面凹孔小瓷珠用于細(xì)菌的吸附和保存，甘油做為抗凍保護(hù)劑可減少冷凍過程中形成的冰晶，瓷珠菌種保存管放置于-20℃或-80℃下便可創(chuàng)造干燥、低溫、缺營養(yǎng)的環(huán)境，使菌株處于“休眠” 狀態(tài)，方可長期保存，同時菌種保存管的取用和保存較為便利，復(fù)蘇時間短，不需要平衡至室溫，即取即用，取用復(fù)蘇及保存菌株僅需1分鐘。而且一個瓷珠管中有多個小瓷珠，保存一次可進(jìn)行多次復(fù)蘇。
4.定期復(fù)蘇和驗證
定期復(fù)蘇：定期復(fù)蘇菌株，檢查其活性和遺傳穩(wěn)定性。
驗證特性：通過生理生化實(shí)驗或基因組測序，驗證菌株的特性是否發(fā)生變化。
四、實(shí)際應(yīng)用中的注意事項
1.選擇合適的保存方法：根據(jù)菌株的特性和實(shí)驗需求，選擇最適合的保存方法。
2.記錄保存信息：詳細(xì)記錄菌株的保存條件、凍存次數(shù)和復(fù)蘇情況，便于追溯和管理。
3.避免污染：在凍存和解凍過程中，嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)范，避免污染。
五、結(jié)語
反復(fù)凍存對菌株的活性、遺傳穩(wěn)定性及實(shí)驗結(jié)果可靠性具有顯著影響。通過減少凍存次數(shù)、優(yōu)化凍存條件、采用替代保存方法以及定期復(fù)蘇和驗證，可以有效降低反復(fù)凍存的負(fù)面影響，確保菌株資源的長期穩(wěn)定性和實(shí)驗結(jié)果的可靠性。在微生物研究和工業(yè)生產(chǎn)中，科學(xué)管理菌株資源是確保實(shí)驗成功和生產(chǎn)效率的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。希望本文能為相關(guān)從業(yè)者提供有價值的參考，助力微生物資源的可持續(xù)利用。
