利用抗生素抗性基因篩選

這是一種最早發(fā)展而且目前仍廣泛使用的方法。在DNA重組載體設計時已經(jīng)在質(zhì)粒中裝配了抗生素抗性基因標記，如四環(huán)素抗性基因（Tet^r）、氨芐青霉素抗性基因（Amp^r）、卡那霉素抗性基因（Kan^r）等。當編碼有這些抗藥性基因的質(zhì)粒攜帶目的基因進入宿主細胞后，細胞就具有了相應的抗生素抗性，如果在篩選平板的培養(yǎng)基中加入有關(guān)抗生素，只有含質(zhì)粒的細胞才能生長。這種方法只能證明細胞中確實已經(jīng)有質(zhì)粒存在，但無法保證質(zhì)粒中已經(jīng)攜帶了目的基因。為了防止誤檢，人們進一步發(fā)展了采用插入缺失的方法，同一質(zhì)粒中往往有兩種抗藥性基因，在體外重組時故意將目的DNA插入到其中一個抗性基因中，使其失活，這樣得到的宿主細胞便可在含另一抗生素的培養(yǎng)基中存活，但在兩種抗生素都加入的平板上則不能生長。將這種菌株篩選出來，就能保證細胞中的重組質(zhì)粒確實已經(jīng)插入了目的基因。由于需要兩次篩選，操作比較麻煩。

例如pBR322質(zhì)粒上有兩個抗生素抗性基因，抗氨芐青霉素基因（Amp^r）上有單一的 PstI位點，抗四環(huán)素基因（Tet^r）上有Sal I和BamH I位點。當外源DNA片段插入到 Sal I/BamH I位點時，使抗四環(huán)素基因失活，這時含有重組體的菌株從Amp^rTet^r變?yōu)锳mp^r Tet⁸。這樣，凡是在Amp^r平板上生長而在Amp^rTet^r平板上不能生長的菌落就可能是所要的重組體。