雙熒光素酶報告基因測試
在用螢火蟲熒光素酶定量基因表達時 ，通常采用第二個報告基因來減少實驗的變化因素。但傳統(tǒng)的共報告基因（比如CAT，β-Gal，GUS）不夠便利。因為各自的測試化學(xué)，處理要求，檢測特點存在差異。
Promega提供一種先進的雙報告基因技術(shù)，結(jié)合了螢火蟲熒光素酶測試和海洋腔腸熒光素酶測試。雙熒光素酶報告基因測試系統(tǒng)，結(jié)合pRL載體系統(tǒng)，表達第二個報告基因海洋腔腸熒光素酶，在單管中進行雙熒光素酶報告基因測試，快速，靈敏，簡便。
系統(tǒng)還提供PLB裂解液，用來裂解在多孔板中培養(yǎng)的哺乳細胞，不需操作單個樣品。對于正在使用螢火蟲熒光素酶報告基因載體的研究人員。雙熒光素酶報告基因測試系統(tǒng)將使他們立即體會到該系統(tǒng)的便利。
介 紹
雙報告基因用于實驗系統(tǒng)中作相關(guān)的或成比例的檢測，通常一個報告基因作為內(nèi)對照，使另一個報告基因的檢測均一化。檢測基因表達時雙報告基因通常用來瞬時轉(zhuǎn)染培養(yǎng)細胞，帶有實驗報告基因的載體共轉(zhuǎn)染帶有不同的報告基因作為對照的第二個載體。
通常實驗報告基因偶聯(lián)到調(diào)控的啟動子， 研究調(diào)控基因的結(jié)構(gòu)和生理基礎(chǔ)。報告基因表達活力的相對改變與偶聯(lián)調(diào)控啟動子轉(zhuǎn)錄活力的改變相關(guān)，偶聯(lián)到組成型啟動子的第二個報告基因，提供轉(zhuǎn)錄活力的內(nèi)對照， 使測試不被實驗條件變化所干擾。
通過這種方法，可減少內(nèi)在的變化因素所削弱的實驗準確性，比如，培養(yǎng)細胞的數(shù)目和活力的差別，細胞轉(zhuǎn)染和裂解的效率。
使用螢火蟲熒光素酶，結(jié)合氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（CAT），β-半乳糖苷酶（β-Gal），或葡萄醛酸糖苷酶（GUS）的雙報告基因，近幾年已普遍使用。
但這些雙報告基因組合削弱了熒光 素酶操作的優(yōu)勢 , 比如熒光素酶測試和定量可在幾秒鐘內(nèi)進行， 但CAT，β-Gal和GUS測試法， 則在定量前需要長時間的保溫。另外，這些報告基因受限于它們的靈敏度和線性應(yīng)答范圍， 必須注意不要超過這些范圍，內(nèi)源性細胞活力也會干擾這類報告基因的使用。
許多類型的細胞有內(nèi)源β-Gal或GUS表達，不利于準確定量報告基因表達， 胞內(nèi)去乙酰酶活力干擾CAT活力測試。盡管在高溫下預(yù)處理細胞裂解液，會降低內(nèi)源性β-Gal和CAT測試的干擾，但這些處理也會快速失活熒光素酶。因此，在此類雙報告基因檢測中， 必須以不同的步驟分別處理共轉(zhuǎn)染的細胞裂解液。
理想的雙報告基因方法應(yīng)該使用戶能夠以螢火蟲熒光素酶所具有的速度，靈敏和線性范圍對同一樣品中的兩個報告基因同時測定。這在傳統(tǒng)的報告基因， 如CAT，β-Gal和GUS是不可能的，由于它們測試化學(xué)，處理要求所固有的局限。
相反，結(jié)合螢火蟲 （ Photinus pyralis ） 和海洋腔腸 （ Renilla reniformis ） 雙熒光素酶，Promega 的雙熒光素酶報告基因測試 （DLR） 系統(tǒng)可滿足這些要求，在單管中完成這些測試。
雙熒光素酶報告基因測試化學(xué)
熒火蟲和海洋腔腸熒光素酶都具有生物發(fā)光報告基因的卓越的測試特點，但它們在進化上的起源不同，因此，具有不同的酶學(xué)結(jié)構(gòu)和底物要求。這些差別用來發(fā)展了DLR 測試化學(xué)，選擇性地區(qū)別這兩種發(fā)光報告基因的活力。
螢火蟲熒光素酶是一個61kDa單亞基蛋白質(zhì)，酶活力不需翻譯后修飾，在翻譯后即可作為遺傳報告基因。在ATP，Mg2+ 和 O2存在下，通過甲蟲熒光素的氧化反應(yīng)發(fā)光（圖1）。
在常規(guī)反應(yīng)條件下，熒光素的氧化發(fā)生時，以熒光素-AMP作為中間體，轉(zhuǎn)換非常緩慢。結(jié)果，在底物和酶混合后，測試化學(xué)產(chǎn)生“閃爍”的光，并迅速衰減。專利化的測試試劑，定量螢火蟲熒光素酶活力，摻入了輔酶A（CoA）， 增強快速酶轉(zhuǎn)換來提高反應(yīng)動力學(xué)， 導(dǎo)致持續(xù)的“閃爍”發(fā)光信號 （圖2） 。
圖1 由螢火蟲和Renilla熒光素酶催化的生物發(fā)光
海洋腔腸熒光素酶，一個36kDa單亞基蛋白質(zhì)，純化自天然來源的Renilla reniformis，含有3%的碳水化合物，但是和螢火蟲熒光素酶一樣，酶活力不需翻譯后修飾，在翻譯后即可作為遺傳報告基因。
海洋腔腸熒光素酶所催化的發(fā)光反應(yīng)，利用O2和海樣腔腸熒光素（coelenterazine）（圖1）。當(dāng)用DLR測試化學(xué)作實驗時，海洋腔腸熒光素酶反應(yīng)的動力學(xué)產(chǎn)生閃爍型發(fā)光信號，在檢測過程中緩慢地衰減（圖2）。
在DLR測試系統(tǒng)中，用單個裂解液分步測定螢火蟲和海洋腔腸熒光素酶活力。在完成螢火蟲熒光素酶活力（“實驗”報告基因）的測定后，螢火蟲發(fā)光被快速湮滅，并同時激活海洋腔腸熒光素酶的發(fā)光反應(yīng)（“對照” 報告基因）。
因此，DLR測試系統(tǒng)整合了兩個測試化學(xué)，對共表達的兩個報告基因作快速地定量，酶來自轉(zhuǎn)染細胞裂解液，或無細胞轉(zhuǎn)錄翻譯反應(yīng)。
螢火蟲熒光素酶測試的線性范圍延伸達酶濃度的8個數(shù)量級，可測定≤1fg （大約10 -20 摩爾）的實驗報告基因酶（圖3A）。用雙熒光素酶報告基因測試系統(tǒng)，海洋腔腸熒光素酶的線性范圍達酶濃度的7個數(shù)量級，較低的底限是≤10fg （大約3×10 -19 摩爾）的對照報告基因酶（圖3B），并且這兩個酶的特異活力相似。
圖2 用雙熒光素酶報告基因測試由螢火蟲和Renilla熒光素酶產(chǎn)生的發(fā)光。CHO細胞（1×106 /60mm培養(yǎng)板）共轉(zhuǎn)染pGL3
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