核酸的定量測(cè)定——定磷法
[原理]
磷的測(cè)定方法很多，F(xiàn)iske-Subbarow定磷法是一經(jīng)典的但至今仍被經(jīng)常采用的方法，它具有靈敏、簡(jiǎn)便的特點(diǎn)。各種含磷有機(jī)物經(jīng)硫酸或過氯酸水解，使有機(jī)磷消化成為無機(jī)磷。無機(jī)磷在酸性條件下，與鉬酸鹽（常用鉬酸銨或鉬酸鈉）反應(yīng)生成磷鉬酸鹽絡(luò)合物。
用還原劑處理，磷鉬酸鹽絡(luò)合物被還原生成鉬藍(lán)，在660nm處有最大光吸收峰。在一定濃度范圍內(nèi)，顏色的深淺與磷含量成正比關(guān)系。因此可應(yīng)用分光光度法進(jìn)行磷的定量測(cè)定。
化學(xué)反應(yīng)式：
(NH 4 ) 2 MoO 4 + H 2 SO 4 → H 2 MoO 4 + (NH 4 ) 2 SO 4
H 3 PO 4 + 12H 2 MoO 4 → H 3 P (Mo 3 O 10 ) 4 + 12H 2 O
還原劑
H 3 P (Mo 3 O 10 ) 4 → Mo 2 O 3 MoO 3
核酸是一類含磷化合物，其分子含有一定比例的磷，一般純的RNA及其核苷酸含磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9.0%；DNA及其核苷酸含磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9.2%，即每100g核酸含有9.0～9.2g磷，也就是核酸量是含磷量的11倍左右，故測(cè)得磷的量，即可求得核酸量。這就是定磷法的理論依據(jù)，磷的定量測(cè)定是測(cè)定核酸含量常用手段之一。
生物有機(jī)磷材料中有時(shí)含有無機(jī)磷雜質(zhì)，故用定磷法來測(cè)定該有機(jī)磷物質(zhì)的量時(shí)，必須分別測(cè)定該樣品的總磷量，即樣品經(jīng)過消化以后所測(cè)得的含磷量，以及該樣品的無機(jī)磷含量，即樣品未經(jīng)消化直接測(cè)得的含磷量。將總磷量減去無機(jī)磷才是該有機(jī)磷物質(zhì)的含磷量。
[方法和步驟]
1、 磷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
取試管7支，0～6依次編號(hào)。按下表加入各 試劑 。注意每加好一種 試劑 后應(yīng)立即搖勻。
管號(hào) 名稱 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
標(biāo)準(zhǔn)磷溶液/mL | 0 | 0.5 | 1.0 | 1.5 | 2.0 | 2.5 | 3.0 |
6 mol/L 硫酸/mL | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
25g/L鉬酸銨/mL | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
還原劑/mL | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 |
蒸餾水/mL | 3.9 | 3.4 | 2.9 | 2.4 | 1.9 | 1.4 | 0.9 |
各反應(yīng)液加畢后，于30℃保溫20min，置分光光度計(jì)中在波長(zhǎng)660nm比色，測(cè)光吸收值。以磷含量為橫坐標(biāo)，光吸收值為縱坐標(biāo)作圖，即得定磷標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2、總磷量的測(cè)定
取30毫升凱氏燒瓶2只，Ⅰ、Ⅱ依次編號(hào)，Ⅰ號(hào)瓶為空白對(duì)照，用刻度吸管準(zhǔn)確吸取核糖核酸樣液1.0mL，置于Ⅱ號(hào)凱氏燒瓶?jī)?nèi)，Ⅰ號(hào)瓶加入蒸餾水1.0mL，不加樣液，兩瓶分別加入6mol/L硫酸1.0mL置消化架用小火加熱消化，待溶液呈褐色，稍加冷卻，加入2 mol/L硝酸2滴，再繼續(xù)加熱，直至逸出白色煙霧，溶液無色透明，表示消化完成時(shí)為止。
待凱氏燒瓶冷卻后，分別加入1.0mL蒸餾水，置沸水浴蒸煮5min，使焦磷酸分解。凱氏燒瓶從沸水浴中取出，待其冷卻，將Ⅰ和Ⅱ號(hào)瓶?jī)?nèi)的消化液分別移入兩只10毫升容量瓶中，用少量蒸餾水洗滌凱氏燒瓶?jī)纱危⑾礈煲阂徊⒌谷肴萘科績(jī)?nèi)，再各加蒸餾水稀釋至刻度。
取試管3支，按7～9依次編號(hào)，7號(hào)管為空白對(duì)照。
準(zhǔn)確吸取空白對(duì)照液1.0mL，置于7號(hào)管內(nèi)，再分別準(zhǔn)確吸取Ⅱ號(hào)瓶經(jīng)過消化的核糖核酸樣液1.0mL，置于8、9號(hào)管內(nèi)，以下操作與磷標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制相同。測(cè)出光密度，即可由繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線查得核糖核酸經(jīng)消化稀釋后的總磷量。
3、無機(jī)磷的測(cè)定
取試管3支，按10～12依次編號(hào)，10號(hào)管為空白對(duì)照。
用刻度吸管分別準(zhǔn)確吸取未經(jīng)消化的核糖核酸液1.0mL，作為無機(jī)磷測(cè)定樣液，置于11、12號(hào)管內(nèi)，空白管以蒸餾水代替RNA液，以下操作與磷標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制相同。測(cè)出光密度，即可由繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線查得無機(jī)磷含量。若溶液渾濁，影響測(cè)定光密度，可在加入試劑搖勻后，進(jìn)行過濾或置 離心機(jī) 3 000r/min離心15min，取其上清液再測(cè)定。
4、有機(jī)磷的測(cè)定
按上述方法分別測(cè)得總磷和無機(jī)磷的光密度，自總磷的光密度扣除無機(jī)磷的光密度，即為消化稀釋后樣液有機(jī)磷的光密度。
再由磷標(biāo)準(zhǔn)曲線查得有機(jī)磷含量。
[計(jì)算結(jié)果]
計(jì)算樣品中核酸的含量。
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