高效液相色譜、液液色譜、液—固色譜法的固定相和流動相
一、固定相
高效液相色譜固定相以承受高壓能力來分類，可分為剛性固體和硬膠兩大類。剛性固體以二氧化硅為基質，可承受7.0×108～1.0×109Pa的高壓，可制成直徑、形狀、孔隙度不同的顆粒。如果在二氧化硅表面鍵合各種官能團，可擴大應用范圍，它是目前最廣泛使用的一種固定相。硬膠主要用于離子交換和尺寸排阻色譜中，它由聚苯乙烯與二乙烯苯基交聯而成?？沙惺軌毫ι舷逓?.5×108Pa。固定相按孔隙深度分類，可分為表面多孔型和全多孔型固定相兩類。
1. 表面多孔型固定相
它的基體是實心玻璃球，在玻璃球外面覆蓋一層多孔活性材料，如硅膠、氧化硅、離子交換劑、分子 篩、聚酰胺等。這類固定相的多孔層厚度小、孔淺，相對死體積小，出峰迅速、柱效亦高;顆粒較大，滲透性好，裝柱容易，梯度淋洗時能迅速達到平衡，較適合做常規分析。由于多孔層厚度薄，最大允許量受到限制。
2. 全多孔型固定相
由直徑為10nm的硅膠微粒凝聚而成。這類固定相由于顆 粒很細(5～10μm)，孔仍然較淺，傳質速率快，易實現高效、高速。特別適合復雜混合物分離及痕量分析。
二、流動相
由于高效液相色譜中流動相是液體，它對組分有親合力，并參與固定相對組分的競爭，因此，正確選擇流動相直接影響組分的分離度。對流動相溶劑的要求是：
(1)溶劑對于待測樣品，必須具有合適的極性和良好的選擇性。
(2)溶劑與檢測器匹配。對于紫外吸收檢測器，應注意選用檢測器波長比溶劑的紫外截止波長 要長。所謂溶劑的紫外截止波長指當小于截止波長的輻射通過溶劑時， 溶劑對此輻射產生強烈吸收，此時溶劑被看作是光學不
透明的，它嚴重干擾組分的吸收測量。對于折光率檢測器，要求選擇與組分折光率有較大差別的溶劑作流動相，以達到最高靈敏度。
(3)高純度
由于高效液相色譜靈敏度高，對流動相溶劑的純度也
要求高。不純的溶劑會引起基線不穩，或產生“偽峰”。
(4)化學穩定性好
(5)低粘度(粘度適中)若使用高粘度溶劑，勢必增高壓力，不利于分離。常用的低粘度溶劑有丙酮、甲醇和乙腈等;但粘度過低的溶劑也不宜采用，例如戊烷和乙醚等，它們容易在色譜柱或檢測器內形成氣泡，影響分離。
液—固色譜法
液固色譜的固定相是固體吸附劑。吸附劑是一些多孔的固體顆粒物質，位于其表面的原子、離子或分子的性質是多少不同于在內部的原子、離子或分子的性質的。表層的鍵因缺乏覆蓋層結構而受到擾動。因此，表層一般處于較高的能級，存在一些分散的具有表面活性的 吸附中心 。因此，液固色譜法是根據各組分在固定相上的吸附能力的差異進行分離，故也稱為液固吸附色譜。吸附劑吸附試樣的能力，主要取決于吸附劑的比表面積和理化性質，試樣的組成和結構以及洗脫液的性質等。組分與吸附劑的性質相似時，易被吸附，呈現高的保留值;當組分分子結構與吸附劑表面活性中心的剛性幾何結構相適應時，易于吸附。從而使吸附色譜成為分離幾何異構體的有效手段;不同的官能團具有不同的吸附能，因此，吸附色譜可按族分離化合物。吸附色譜對同系物沒有選擇性(即對分子量的選擇性小)，不能用該法分離分子量不同的化合物。
一、液固色譜法固定相
液固色譜法采用的固體吸附劑按其性質可分為極性和非極性兩種類型。極性吸附劑包括硅膠、氧化鋁、氧化鎂、硅酸鎂、分子篩及聚酰胺等。非極性吸附劑最常見的是活性炭。極性吸附劑可進一步分為酸性吸附劑和堿性吸附劑。酸性吸附劑包括硅膠和硅酸鎂等，堿性吸附劑有氧化鋁、氧化鎂和聚酰胺等。酸性吸附劑適于分離堿，如脂肪胺和芳香胺。堿性吸附劑則適于分離酸性溶質，如酚、羧和吡咯衍生物等。各種吸附劑中，最常用的吸附劑是硅膠，其次是氧化鋁。在現代液相色譜中，硅膠不僅作為液固吸附色譜固定相，還可作為液液分配色譜的載體和鍵合相色譜填料的基體。
三、液-固吸附色譜流動相
液相色譜的流動相必須符合下列要求：
(1)能溶解樣品，但不能與樣品發生反應。
(2)與固定相不互溶，也不發生不可逆反應。
(3)粘度要盡可能小，這樣才能有較高的滲透性和柱效。
(4)應與所用檢測器相匹配。例如利用紫外檢測器時，溶
劑要不吸收紫外光。
(5)容易精制、純化、毒性小，不易著火、價格盡量便宜等。在液-固色譜中，選擇流動相的基本原則是 極性大的試樣用極性較強的流動相，極性小的則用低極性流動相。為了獲得合適的溶劑極性，常采用兩種、三種或更多種不同極性的溶劑混合起來使用，如果樣品組分的分配比k值范圍很廣則使用梯度洗脫。
液液色譜法
液液色譜又稱液液分配色譜。在液液色譜中，一個液相作為流動相，而另一個液相則涂漬在很細惰性載體或硅膠上作為固定相。流動相與固定相應互不相溶，兩者之間應有一明顯的分界面。分配色譜過程與兩種互不相溶的液體在一個分液漏斗中進行的溶劑萃取相類似。以氣液分配色譜法一樣，這種分配平衡的總結果導致各組分的差速遷移，從而實現分離。分配系數(K)或分配比(k)小的組分，保留值小，先流出柱。然而與氣相色譜 法不同的是，流動相的種類對分配系數有較大的影響。
一、固定相
液液色譜的固定相由載體和固定液組成。常用的載體有下列幾類：
(1)表面多孔型載體(薄殼型微珠載體)，由直徑為30 ~ 40μm的實心玻璃球和厚度約為1 ～ 2 μm的多孔性外層所組成。
(2)全多孔型載體，由硅膠、硅藻土等材料制成，直徑30 ~ 50 μm的多孔型顆粒。
(3)全多孔型微粒載體，由nm級的硅膠微粒堆積而成，又稱堆積硅珠。這種載體粒度為5 ～ 10 μm。由于顆粒小， 所以柱效高，是目前使用最廣泛的一種載體。
由于液相色譜中，流動相參與選擇作用，流動相極性的微小變化，都會使組分的保留值出現較大的差異。因此，液相色譜中，只需幾種不同極性的固定液即可。如， —氧二丙腈(ODPN)，聚乙二醇(PEG)，十八烷(ODS)和角鯊烷固定液等。
二、流動相
在液液色譜中，除一般要求外，還要求流動相對固定相的溶解度盡可能小，因此固定液和流動相的性質往往處于兩 個極端，例如當選擇固定液是極性物質時，所選用的流動相通常是極性很小的溶劑或非極性溶劑。
以極性物質作為固定相，非極性溶劑作流動相的液液色譜，稱為正相分配色譜，適合于分離極性化合物;反之，如選用非極性物質為固定相，而極性溶劑為流動相的液液色譜稱為反相分配色譜，這種色譜方法適合于分離芳烴、稠環芳烴及烷烴等化合物。
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