凝膠層析法測定蛋白質分子量實驗步驟
一、實驗目的
1. 了解凝膠層析的原理及其應用。
2. 通過測定蛋白質分子量的訓練，初步掌握凝膠層析技術 。
二、實驗原理
凝膠層析又稱排阻層析，凝膠過濾，滲透層析或分子篩層析等。它廣泛地應用于分離、提純、濃縮生物大分子及脫鹽、去熱源等，而測定蛋白質的分子量也是它的重要應用之一。凝膠是一種具有立體網狀結構且呈多孔的不溶性珠狀顆粒物質。用它來分離物質，主要是根據多孔凝膠對不同半徑的蛋白質分子（近于球形）具有不同的排阻效應實現的。亦即它是根據分子大小這一物理性質進行分離純化的。對于某種型號的凝膠，一些大分子不能進入凝膠顆粒內部而完全被排阻在外，只能沿著顆粒間的縫隙流出柱外；而一些小分子 不被排阻，可自由擴散，滲透進入凝膠內部的篩孔，爾后又被流出的洗脫液帶走。分子越小，進入凝膠內部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出柱外，而大分子先從柱中流出。一些中等大小的分子介于大分子與小分子之間，只能進入一部分凝膠較大的孔隙，亦即部分排阻，因此這些分子從柱中流出的順序也介于大、小分子之間。這樣樣品經過凝膠層析后，分子便按照從大到小的順序依次流出，達到分離的目的。
凝膠層析分離原理。
對于任何一種被分離的化合物在凝膠層析柱 中被排阻的范圍均在0～100%之間，其被排阻的程度可以用有效分配系數Kav（分離化合物在內水和外水體積中的比例關系）表示，Kav值的大小和凝膠柱床的總體積（Vt）、外水體積（V0）以及分離物本身的洗脫體積（Ve）有關：
Kav = (Ve－V0)/(Vt－V0) ----------- (1)
在限定的層析條件下，Vt和V0都是恒定值，而Ve是隨著分離物分子 量的變化而改變。分子量大，Ve值小，Kav值也小。反之，分子量小Ve值大，Kav值大。
65頁的“圖 3－6”畫出了凝膠層析柱中凝膠自身（基質）體積（Vg）、外水體積（V0）、內水體積（Vi）及柱床總體積（Vt）的示意圖。
65頁的“圖 3－7”示出了凝膠層析柱中的幾種層析峰。
有效分配系數Kav是判斷分離效果的一個重要參數，同時也是測定蛋白質分子量的一個依據。在相同層析條件下，被分離物質Kav值差異越大，分離效果越好。反之，分離效果差或根本不能分開。在實際的實驗中，我們可以實測出Vt、V0及Ve的值，從而計算出Kav的大小。對于某一特定型號的凝膠，在一定的分子量范圍內，Kav與logMw (Mw表示物質的分子量) 成線性關系：
Kav ＝－b logMw + C --------- (2)
其中 b,C為常數。
同樣可以得到：
Ve ＝－b’logMw + C’ --------- (3)
其中 b’, C’為常數。即 Ve 與 logMw 也成線性關系。我們可以通過在一凝膠柱上分離多種已知分子量的蛋白質后，并根據上述的線性關系繪出標準曲線，然后用同一凝膠柱測出其它未知蛋白的分子量。
三、器材與試劑
（一）器材
1. 玻璃層析柱（(20mm×60cm）
2. 恒流泵（或下口恒壓貯液瓶）
3. 自動部分收集器
4. 紫外分光光度計
5. 100ml試劑瓶
6. 1000ml量筒
7. 250ml燒杯
8. 50ml、100ml燒杯
9. 10ml（或5ml）刻度試管
（二）試劑
1. 標準蛋白
（1）牛血清白蛋白：Mw=67,000（上海生化所）
（2）雞卵清清蛋白：Mw=45,000（美國SIGMA公司）
（3）胰凝乳蛋白酶原A：Mw=24,000（美國SIGMA公司）
（4）溶菌酶：Mw =14,300
2. 未知蛋白質樣品：由實驗室準備
3. 0.025M KCl－0.1M HAC(乙酸)（洗脫液1000ml）
儀器和試劑
儀器：層析柱、恒流泵、紫外檢測儀、自動部分收集器
試劑
待測樣品：胰島素、牛血清白蛋白
藍色葡聚糖2000;Sephardex G-75;洗脫劑
實驗步驟
1.凝膠溶脹
凝膠顆粒要求大小比較均勻 ，可流速穩定，結果較好。
取葡聚糖Sephardex G-75干粉，加過量的蒸餾水室溫充分溶脹一天(溶脹時間因凝膠交聯度不同而不同)，或沸水浴中溶脹3小時，這樣可大大縮短溶脹時間，而且可以殺死細菌和霉菌，并可排出凝膠內氣泡。溶脹過程中注意不要過分攪拌，以防顆粒破碎。待溶脹平衡后用傾瀉法除去不易沉下的細小顆粒，最后凝膠經減壓抽氣除去氣泡，即可準備裝柱。
2. 裝柱與平衡
裝柱前須將凝膠上面過多的溶液傾出，將層析柱垂直裝好。關閉出口，向柱管內加入約1/3柱容積的洗脫液，然后在攪拌下，將濃漿狀的凝膠連續地傾入柱中，使之自然沉降，待凝膠沉降約2—3cm后，打開柱的出口，調節合適的流速，使凝膠繼續沉集，待沉集的膠面上升到離柱的頂端約5cm處時停止裝柱，關閉出水口。裝柱要求連續、均勻、無氣泡、無“紋路”。
將洗脫劑與恒流泵相連，恒流泵出口端與層析柱相連。通過2—3倍柱床容積的洗脫液使柱床平衡，然后在凝膠表面上放一片濾紙或尼龍濾布，以防將來在加樣時凝膠被沖起，并始終保持凝膠上端有一段液體。
3. 上樣與洗脫
樣品上柱是實驗成敗的關鍵之一，若樣品稀釋或上柱不均，會使區帶擴散，影響層析效果。上樣時應盡量保持床面的穩定。先打開柱的出口，待柱中洗脫液流至距床表面1～2mm時，關閉出口，用滴管將1ml樣品慢慢地加至柱床表面，應避免將床面凝膠沖起，打開出口并開始計算流出體積，當樣品滲入床中接近床表面1mm時關閉出口。按加樣操作，用少量(約1ml)洗脫液沖洗管壁2次。最后加入少量洗脫液于凝膠上，使高出床表面3～5cm，旋緊上口螺絲帽，柱進水口連通恒流泵，調好流速，以每管3ml/10min流速開始洗脫。上樣的體積，分析用量為柱床容積的1—2%;制備用量為柱床容積的20%~30%。
4. 收集與鑒定
用自動部分收集器收集流出液，每管4ml，紫外檢測儀280nm波長處檢測，最高的一個OD值時的體積即為吸收峰的洗脫體積Ve。
5.凝膠柱的處理
凝膠用過后，反復用蒸餾水洗后保存，如果有顏色或比較臟，可用0.5mol/LNaCl洗滌。短期可保存在水相中，加入防腐劑或加熱滅菌后于低溫保存。建議長期用干燥狀態保存。
計算
分子量的測定和計算，一般都采用標準曲線法。只要測得幾種標準蛋白質相對分子質量的Ve，并以它們的相對分子質量的對數(logMr)對Ve作圖得一直線，再測出待測樣品的Ve，即可從圖中確定它的相對分子質量。
注意事項
各接頭不能漏氣，連續用的小乳膠管不要有破損，否則造成漏氣、漏液。注意恒壓瓶內的排氣管應無液體，并隨著柱下口溶液的流出不斷有氣泡產生，則表示恒壓瓶不漏氣。操作過程中，層析柱內液面不斷下降，則表示整個系統有漏氣之處，應仔細檢查并加以糾正。
始終保持柱內液面高于凝膠表面，否則水分揮發，凝膠變干。也要防止液體流干，使凝膠混入大量氣泡，影響液體在柱內的流動，導致分離效果變壞，不得不重新裝柱。
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