凝膠層析法測定蛋白質(zhì)分子量實(shí)驗(yàn)步驟
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/strong>
1. 了解凝膠層析的原理及其應(yīng)用。
2. 通過測定蛋白質(zhì)分子量的訓(xùn)練，初步掌握凝膠層析技術(shù) 。
二、實(shí)驗(yàn)原理
凝膠層析又稱排阻層析，凝膠過濾，滲透層析或分子篩層析等。它廣泛地應(yīng)用于分離、提純、濃縮生物大分子及脫鹽、去熱源等，而測定蛋白質(zhì)的分子量也是它的重要應(yīng)用之一。凝膠是一種具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)且呈多孔的不溶性珠狀顆粒物質(zhì)。用它來分離物質(zhì)，主要是根據(jù)多孔凝膠對不同半徑的蛋白質(zhì)分子（近于球形）具有不同的排阻效應(yīng)實(shí)現(xiàn)的。亦即它是根據(jù)分子大小這一物理性質(zhì)進(jìn)行分離純化的。對于某種型號的凝膠，一些大分子不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部而完全被排阻在外，只能沿著顆粒間的縫隙流出柱外；而一些小分子 不被排阻，可自由擴(kuò)散，滲透進(jìn)入凝膠內(nèi)部的篩孔，爾后又被流出的洗脫液帶走。分子越小，進(jìn)入凝膠內(nèi)部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出柱外，而大分子先從柱中流出。一些中等大小的分子介于大分子與小分子之間，只能進(jìn)入一部分凝膠較大的孔隙，亦即部分排阻，因此這些分子從柱中流出的順序也介于大、小分子之間。這樣樣品經(jīng)過凝膠層析后，分子便按照從大到小的順序依次流出，達(dá)到分離的目的。
凝膠層析分離原理。
對于任何一種被分離的化合物在凝膠層析柱 中被排阻的范圍均在0～100%之間，其被排阻的程度可以用有效分配系數(shù)Kav（分離化合物在內(nèi)水和外水體積中的比例關(guān)系）表示，Kav值的大小和凝膠柱床的總體積（Vt）、外水體積（V0）以及分離物本身的洗脫體積（Ve）有關(guān)：
Kav = (Ve－V0)/(Vt－V0) ----------- (1)
在限定的層析條件下，Vt和V0都是恒定值，而Ve是隨著分離物分子 量的變化而改變。分子量大，Ve值小，Kav值也小。反之，分子量小Ve值大，Kav值大。
65頁的“圖 3－6”畫出了凝膠層析柱中凝膠自身（基質(zhì)）體積（Vg）、外水體積（V0）、內(nèi)水體積（Vi）及柱床總體積（Vt）的示意圖。
65頁的“圖 3－7”示出了凝膠層析柱中的幾種層析峰。
有效分配系數(shù)Kav是判斷分離效果的一個(gè)重要參數(shù)，同時(shí)也是測定蛋白質(zhì)分子量的一個(gè)依據(jù)。在相同層析條件下，被分離物質(zhì)Kav值差異越大，分離效果越好。反之，分離效果差或根本不能分開。在實(shí)際的實(shí)驗(yàn)中，我們可以實(shí)測出Vt、V0及Ve的值，從而計(jì)算出Kav的大小。對于某一特定型號的凝膠，在一定的分子量范圍內(nèi)，Kav與logMw (Mw表示物質(zhì)的分子量) 成線性關(guān)系：
Kav ＝－b logMw + C --------- (2)
其中 b,C為常數(shù)。
同樣可以得到：
Ve ＝－b’logMw + C’ --------- (3)
其中 b’, C’為常數(shù)。即 Ve 與 logMw 也成線性關(guān)系。我們可以通過在一凝膠柱上分離多種已知分子量的蛋白質(zhì)后，并根據(jù)上述的線性關(guān)系繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后用同一凝膠柱測出其它未知蛋白的分子量。
三、器材與試劑
（一）器材
1. 玻璃層析柱（(20mm×60cm）
2. 恒流泵（或下口恒壓貯液瓶）
3. 自動部分收集器
4. 紫外分光光度計(jì)
5. 100ml試劑瓶
6. 1000ml量筒
7. 250ml燒杯
8. 50ml、100ml燒杯
9. 10ml（或5ml）刻度試管
（二）試劑
1. 標(biāo)準(zhǔn)蛋白
（1）牛血清白蛋白：Mw=67,000（上海生化所）
（2）雞卵清清蛋白：Mw=45,000（美國SIGMA公司）
（3）胰凝乳蛋白酶原A：Mw=24,000（美國SIGMA公司）
（4）溶菌酶：Mw =14,300
2. 未知蛋白質(zhì)樣品：由實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)備
3. 0.025M KCl－0.1M HAC(乙酸)（洗脫液1000ml）
儀器和試劑
儀器：層析柱、恒流泵、紫外檢測儀、自動部分收集器
試劑
待測樣品：胰島素、牛血清白蛋白
藍(lán)色葡聚糖2000;Sephardex G-75;洗脫劑
實(shí)驗(yàn)步驟
1.凝膠溶脹
凝膠顆粒要求大小比較均勻 ，可流速穩(wěn)定，結(jié)果較好。
取葡聚糖Sephardex G-75干粉，加過量的蒸餾水室溫充分溶脹一天(溶脹時(shí)間因凝膠交聯(lián)度不同而不同)，或沸水浴中溶脹3小時(shí)，這樣可大大縮短溶脹時(shí)間，而且可以殺死細(xì)菌和霉菌，并可排出凝膠內(nèi)氣泡。溶脹過程中注意不要過分?jǐn)嚢瑁苑李w粒破碎。待溶脹平衡后用傾瀉法除去不易沉下的細(xì)小顆粒，最后凝膠經(jīng)減壓抽氣除去氣泡，即可準(zhǔn)備裝柱。
2. 裝柱與平衡
裝柱前須將凝膠上面過多的溶液傾出，將層析柱垂直裝好。關(guān)閉出口，向柱管內(nèi)加入約1/3柱容積的洗脫液，然后在攪拌下，將濃漿狀的凝膠連續(xù)地傾入柱中，使之自然沉降，待凝膠沉降約2—3cm后，打開柱的出口，調(diào)節(jié)合適的流速，使凝膠繼續(xù)沉集，待沉集的膠面上升到離柱的頂端約5cm處時(shí)停止裝柱，關(guān)閉出水口。裝柱要求連續(xù)、均勻、無氣泡、無“紋路”。
將洗脫劑與恒流泵相連，恒流泵出口端與層析柱相連。通過2—3倍柱床容積的洗脫液使柱床平衡，然后在凝膠表面上放一片濾紙或尼龍濾布，以防將來在加樣時(shí)凝膠被沖起，并始終保持凝膠上端有一段液體。
3. 上樣與洗脫
樣品上柱是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵之一，若樣品稀釋或上柱不均，會使區(qū)帶擴(kuò)散，影響層析效果。上樣時(shí)應(yīng)盡量保持床面的穩(wěn)定。先打開柱的出口，待柱中洗脫液流至距床表面1～2mm時(shí)，關(guān)閉出口，用滴管將1ml樣品慢慢地加至柱床表面，應(yīng)避免將床面凝膠沖起，打開出口并開始計(jì)算流出體積，當(dāng)樣品滲入床中接近床表面1mm時(shí)關(guān)閉出口。按加樣操作，用少量(約1ml)洗脫液沖洗管壁2次。最后加入少量洗脫液于凝膠上，使高出床表面3～5cm，旋緊上口螺絲帽，柱進(jìn)水口連通恒流泵，調(diào)好流速，以每管3ml/10min流速開始洗脫。上樣的體積，分析用量為柱床容積的1—2%;制備用量為柱床容積的20%~30%。
4. 收集與鑒定
用自動部分收集器收集流出液，每管4ml，紫外檢測儀280nm波長處檢測，最高的一個(gè)OD值時(shí)的體積即為吸收峰的洗脫體積Ve。
5.凝膠柱的處理
凝膠用過后，反復(fù)用蒸餾水洗后保存，如果有顏色或比較臟，可用0.5mol/LNaCl洗滌。短期可保存在水相中，加入防腐劑或加熱滅菌后于低溫保存。建議長期用干燥狀態(tài)保存。
計(jì)算
分子量的測定和計(jì)算，一般都采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法。只要測得幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的Ve，并以它們的相對分子質(zhì)量的對數(shù)(logMr)對Ve作圖得一直線，再測出待測樣品的Ve，即可從圖中確定它的相對分子質(zhì)量。
注意事項(xiàng)
各接頭不能漏氣，連續(xù)用的小乳膠管不要有破損，否則造成漏氣、漏液。注意恒壓瓶內(nèi)的排氣管應(yīng)無液體，并隨著柱下口溶液的流出不斷有氣泡產(chǎn)生，則表示恒壓瓶不漏氣。操作過程中，層析柱內(nèi)液面不斷下降，則表示整個(gè)系統(tǒng)有漏氣之處，應(yīng)仔細(xì)檢查并加以糾正。
始終保持柱內(nèi)液面高于凝膠表面，否則水分揮發(fā)，凝膠變干。也要防止液體流干，使凝膠混入大量氣泡，影響液體在柱內(nèi)的流動，導(dǎo)致分離效果變壞，不得不重新裝柱。
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