小鼠雌激素（E）酶聯免疫分析（ELISA
試劑 盒使用說明書
本試劑僅供研究使用 目的：本試劑盒用于測定小鼠血清，血漿及相關液體樣本中 雌激素（E） 含量。
實驗原理 ：
本試劑盒應用 雙抗體 夾心法測定 標本 中 小鼠的 雌激素（E） 水平。用純化的 小鼠 雌激素（E） 抗體 包被微孔板，制成固相 抗 體，往包被 單抗 的微孔中加入 雌二醇（E） ，再與HRP 標記的 雌二醇（E） 抗體結合，形成抗體- 抗原 - 酶標抗體復合物 ，經過徹底洗滌后 加 底物TMB 顯色。
TMB 在 HRP 酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的 雌激素（E） 呈正相關。用酶標儀在 450 nm波長下測定吸光度（ OD 值）， 通過標準曲線 計算樣品 中 小鼠 雌激素（E） 的含量。
試劑盒組成 ：
試劑盒組成 | 48孔配置 | 96孔配置 | 保存 |
說明書 | 1份 | 1份 | |
封板膜 | 2片（ 48 ） | 2片（ 96 ） | |
密封袋 | 1個 | 1個 | |
酶標包被板 | 1 ×48 | 1 ×96 | 2-8℃保存 |
標準品： 54 pmol/L | 0.5ml× 1 瓶 | 0.5ml× 1 瓶 | 2-8℃保存 |
標準品稀釋液 | 1.5ml× 1 瓶 | 1.5ml× 1 瓶 | 2-8℃保存 |
酶標試劑 | 3 ml× 1 瓶 | 6 ml× 1 瓶 | 2-8℃保存 |
樣品稀釋液 | 3 ml× 1 瓶 | 6 ml× 1 瓶 | 2-8℃保存 |
顯色劑A 液 | 3 ml× 1 瓶 | 6 ml× 1 瓶 | 2-8℃保存 |
顯色劑B 液 | 3 ml× 1 瓶 | 6 ml× 1 瓶 | 2-8℃保存 |
終止液 | 3ml× 1 瓶 | 6ml× 1 瓶 | 2-8℃保存 |
濃縮洗滌液 | （20ml × 20 倍）× 1 瓶 | （20ml × 30 倍）× 1 瓶 | 2-8℃保存 |
樣本處理及要求 ：
1. 血清：室溫血液自然凝固 10-20 分鐘，離心 20 分鐘左右（ 2000-3000 轉 / 分）。仔細收集上清，保存過程中如出現沉淀，應再次離心。
2. 血漿：應根據標本的要求選擇 EDTA 或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合 10-20 分鐘后，離心 20 分鐘左右（ 2000-3000 轉 / 分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應該再次離心。
3. 尿液：用無菌管收集，離心 20 分鐘左右（ 2000-3000 轉 / 分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。
4. 細胞培養上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心 20 分鐘左右（ 2000-3000 轉 / 分）。仔細收集上清。
檢測細胞內的成份時，用 PBS （ PH7.2-7.4 ）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到 100 萬 /ml 左右。通過反復凍融，以使細胞破壞并放出細胞內成份。離心 20 分鐘左右（ 2000-3000 轉 / 分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。
5. 組織標本：切割標本后，稱取重量。加入一定量的 PBS ， PH7.4 。用液氮迅速冷凍保存備用。標本融化后仍然保持 2-8 ℃的溫度。加入一定量的 PBS （ PH7.4 ），用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心 20 分鐘左右（ 2000-3000 轉 / 分）。仔細收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。
6. 標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可 將標本放于 -20 ℃保存，但 應 避免反復凍融 .
7. 不能檢測含NaN3的樣品 ，因NaN3 抑制辣根過氧化物酶的（ HRP ）活性。
操作步驟
1. 標準品的稀釋與加樣：在酶標包被板上設標準品孔10 孔，在第一、第二孔中分別加標準品 100 μ l，然后在第一、第二孔中加標準品稀釋液 50 μ l，混勻；然后從第一孔、第二孔中各取 100 μ l分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標準品稀釋液 50 μ l，混勻；
然后在第三孔和第四孔中先各取 50 μ l棄掉，再各取 50 μ l分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標準品稀釋液 50ul ，混勻；
混勻后從第五、第六孔中各取 50 μ l分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標準品稀釋液 50 μ l，混勻后從第七、第八孔中分別取 50 μ l加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標準品稀釋液 50 μ l，混勻后從第九第十孔中各取 50 μ l棄掉。
（稀釋后各孔加樣量都為 50 μ l，濃度分別為 36 pmol/L ，24 pmol/L ，12 pmol/L ，6 pmol/L ，3 pmol/L）。
2. 加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、 待測樣品孔 。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 μ l，然后再加待測樣品 10 μ l（樣品最終稀釋度為 5 倍）。 加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁， 輕輕 晃動 混勻 。
3. 溫育：用封板膜封板后置37 ℃溫育3 0 分鐘 。
4. 配液：將30 （ 48T 的 20 倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水 30 （ 48T 的 20 倍）倍稀釋后備用。
5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體， 甩干 ，每孔加滿洗滌液，靜置30 秒后棄去，如此重復 5 次，拍干。
6. 加酶：每孔加入酶標試劑50 μ l，空白孔除外 。
7. 溫育：操作同3 。
8. 洗滌：操作同5 。
9. 顯色：每孔先加入顯色劑A50 μ l，再加入顯色劑 B50 μ l，輕輕震蕩混勻， 37 ℃避光顯色15分鐘.
10. 終止：每孔加終止 液50μl ，終止反應 （此時藍色立轉黃色） 。
11. 測定：以空白空調零， 4 50 nm波長依序測量各孔的 吸光 度（OD 值） 。 測定應在加終止液后15 分鐘以內進行。
注意事項：
1． 試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡15-30 分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存。
2． 濃洗滌液 可能 會有 結晶 析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶 ，洗滌時不影響結果。
3． 各步加樣均應使用加樣器，并經常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間最好控制在5 分鐘內，如標本數量多，推薦使用排槍加樣。
4． 請每次測定的同時做標準曲線，最好做復孔。如標本中待測物質含量過高（樣本OD 值大于標準品孔第一孔的 OD 值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數（ n 倍）后再測定，計算時請最后 乘以 總稀釋倍數（ ×n×5 ）。
5． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6． 底物請避光保存。
7． 嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準.
8． 所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。
9． 本試劑不同批號組分不得混用。
10. 如與英文說明書有異，以英文說明書為準。
計算 ：
以標準物的濃度為橫坐標，OD 值為縱坐標，
在坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的OD
值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以 稀釋
倍數 ；或用標準物的濃度與OD 值計算出標
準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD 值
代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以 稀釋
倍數 ，即為樣品的實際濃度。
試劑盒性能：
1.樣品線性回歸與預期濃度相關系數 R 值為 0.990 以上。
2.批內與批見應分別小于 9% 和 11%
保存條件及有效期：
1.試劑盒保存： ；2-8 ℃ 。
2．有效期： 6 個月
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