核酸序列測定

DNA的堿基序列決定著基因的特性，DNA序列分析（測序，sequencing）是分子生物學重要的基本技術。無論從基因庫中篩選的癌基因或經PCR法擴增的基因，最終均需進行核酸序列分析，可藉以了解基因的精細結構，獲得其限制性內切酶圖譜，分析基因的突變及對功能的影響，幫助人工俁成基因、設計引物，以及研究腫瘤的分子發病機制等。測序是在高分辨率變性聚丙烯酰胺凝膠電泳技術的基礎上建立起來的。                                                                                                                                                                                                                                                                             
目前最常用的方法有Maxam-Gilbert的化學降解少和Sanger的雙脫氧法等，近年來已有DNA序列自動測定儀問世?；瘜W降解法是在DNA的片段的5`端標記核素，然后用專一性化學試劑將DNA特異地降 解，在電泳和自顯影后，可得到從標記端延伸的片段供測讀序列和進行比較。一般能讀出200-250個核苷酸序列。雙脫氧法是采用核苷酸鏈終止劑，                                                                                                                       
                                                                                                                     
如：2`，3`-雙脫氧核苷三磷酸ddNTP(如ddTTP、ddTTP、ddGTP和ddCTP中的一種)摻入到DNA鏈中以終止鏈的延長，與摻入4種正常的dNTP的混合物分成四組進行反應，這樣可得到一組結尾長衙不一、不同專一性核苷酸鏈終止劑結尾的DNA片段，經凝膠電泳分離和放射自顯影，可讀出合成的DNA核苷酸序列，根據堿基互補原則，可推算出模板DNA分子的序列。                                                                                         
                                                                                         
化學降解法只需一化學試劑，重復性好，容易掌握；而雙脫氧法需單鏈模板、特異的寡核苷酸引物及高質量的DNA聚合酶，便隨著M13噬菌載體的發明和運用，合成的引物容易獲得，測序技術不斷改進，故此法已被廣泛應用。基脫氧法的自動激光熒光測序儀，使測工作更快速和簡便，而且保證高度重復性。至于RNA測序現大多采用將mRNA逆轉錄成cDNA后同測序，然后反推RNA序列                                                               

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