缺血/再灌注損傷的機制
關于再灌注損傷的發生機制問題，到目前為止，學說雖多而且有的學說也頗為有力，便尚未得到徹底闡明。茲介紹如下：
一、無復流現象
無復流現象（no-reflow phenomenon）是在犬的實驗中發現的。結扎犬的冠狀動脈造成局部心肌缺血后，再打開結扎的動脈，使血流重新開放，缺血區并不能得到充分的灌注，故稱此現象為無復流或無再灌。這種無復流現象不僅見于心肌，而且也見于腦、腎骼肌缺血后再灌注時。即再灌注損傷實際上是缺血的延續和疊加，缺血細胞并未能得到血液灌注，而是繼續缺血，因而損傷加重。所以發生無復流現象，可能與下列因素有關（以心肌為例）：
（一）心肌細胞腫脹 由于缺血引起細胞膜Na + -K + 泵功能障礙，從而使鈉、水在細胞內潴留，因而再灌注時缺血區心肌細胞發生腫脹，壓迫微血管。
（二）血管內皮細胞腫脹 缺血及再灌注時也發生內皮細胞腫脹，內皮細胞向管腔伸出突起造成管腔狹窄，阻礙血液灌流。內皮細胞的腫脹與氧自由基的增多有關，因為氧自由基可以使血管內皮細胞膜受損，水鈉乃進入內皮細胞而引起細胞水腫。
（三）心肌細胞的收縮缺血所致的心肌細胞收縮形成嚴重收縮帶，壓迫微血管，使缺血區某部分得不到血液重新灌注。心肌細胞的腫脹與收縮帶可同時存在。
（四）微血管堵塞 Feinburg及其同事曾證明，缺血一定時間后血管內血小板的沉積增加2倍。又證明心肌及腸管缺血后的無復流區內白細胞（主要是中性粒細胞）的聚集明顯增加，從組織學上可見白細胞嵌頓、阻塞毛細血管。正常灌注情況下，每2433μm到3261μm長的毛細血管可發現一個白細胞，而在缺血時增加10倍，平均292μm長的毛細血管即有一個白細胞。缺血時紅細胞作疊連狀聚集，但這不是血管阻塞的主要原因。因為疊連狀紅細胞的解聚較白細胞與內皮細胞粘著的分離要容易得多。此外也有人解釋無復流現象是由于纖維蛋白塞和微血栓形成所致。但有人在再灌前用鏈激酶進行纖溶并未減輕無復流現象。
微血管的堵塞還與花生四烯酸的代謝產物前列環毒（PGI 2 ）和血栓素A 2 （TXA 2 ）之間的失衡密切相關。PCI 2 主要由血管內皮生成，除了有很強的擴血管作用以外，還能抑制血小板的聚集。TXA 2 主要由血小板生成，不僅是很強的縮血管物質，而且也是一種引起血小板聚集的因子，因此是一個很強的致血栓形成的物質。缺血缺氧時，一方面因為血管內皮細胞受損而致PCI 2 生成減少，另方面缺氧又可使血小板釋放TXA 2 增多，因而發生強烈的血管收縮和血小板的聚集并進一步釋放TXA 2 ，從而促使血栓形成和血管堵塞。動物實驗也證明，應用TXA 2 合成酶抑 制藥 可以使缺血/再灌注以后的冠脈血流改善。
二、鈣超載
如前所述，鈣反常（無鈣灌流后用含鈣溶液再灌注）時細胞內鈣超載，引起嚴重的功能及結構障礙。鈣反常的原因不甚明了，但主要的損傷是在無鈣灌流期出現的細胞膜外板（external lamina）與糖被膜（glycocalyx）表面的分離（兩者由Ca 2+ 連結在一起）。細胞膜的這種損傷為再灌注時鈣的大量內流提供了條件。在長期缺血缺氧后再給氧或再灌注時也可引起細胞內鈣超載。
①電壓依賴性鈣通道；
②質膜鈣泵ATP酶；
③Na + -Ca 2+ 交換；
④線粒體；
⑤肌漿網；
⑥細胞內蛋白或陰離子結合的鈣；
⑦膜磷脂的極性頭部；
⑧結合于質膜糖被的鈣
（一）鈉的平衡障礙 有人證明，再灌注時鈣超載是由于鈉平衡障礙所致。因為在缺血缺氧時發生了細胞酸中毒，細胞內pH值降低，所以在再灌注時細胞內外形成pH梯度差，由于Na + -H + 交換，致細胞內鈉增加，然后又依Na + -Ca 2+ 交換機制使細胞外鈣大量內流造成細胞鈣超載。
?。ǘ┘毎ねㄍ感栽龈呷毖毖跻鸬募毎嶂卸驹谠俟嘧r通過細胞內外Na + -H + 交換和Na + -Ca 2+ 交換而使細胞內鈣增加，而細胞內鈣增加可激活磷脂酶，使膜磷脂降解，細胞膜通透性增高，故在灌注時細胞外鈣順著濃度梯度而大量內流，細胞膜通透性增高的更重要的原因可能是再灌注時氧自由基的大量產生。氧自由基可引發細胞膜的脂質過氧化，使膜受損，通透性增高。
（三）線粒體受損 有些學者認為原發性損傷在于線粒體。如所周知，缺血時線粒體結構的功能障礙出現最早，表現為線粒體腫脹、嵴斷裂。線粒體膜流動性降低，氧化磷酸化功能受損ATP生成障礙。因此，使上述損傷更為嚴重。
ATP減少使肌膜及肌漿網膜鈣泵功能障礙，由于鈣泵功能障礙不能排出和攝取細胞漿中過多的鈣，致使細胞漿中游離鈣濃度增加而造成鈣超載。細胞漿中過多的鈣最終形成磷酸鹽沉積于線粒體，使線粒體結構及功能更加破壞。
細胞鈣超載是再灌注損傷的一個重要特征，但目前，仍未能搞清它究竟是再灌注損傷的原因抑制或結果。
三、白細胞的作用
白細胞（主要是中性粒細胞）出現于梗塞的心肌中已為尸檢所證實。1984年Mullane及其同事證明，冠狀動脈堵塞60分鐘時心肌組織就有白細胞出現，5小時后在缺血區有大量的白細胞聚集。根據Engler及其同事的研究，再灌注時白細胞數非但不減少反而增加。以犬心肌缺血為模型，再灌注僅5分鐘，心內膜中性粒細胞就增加25％，缺血輕的組織白細胞聚集也少。
組織缺血和再灌注時白細胞浸潤增加的機制還不十分清楚?？赡苁怯捎诮M織受損時，細胞膜磷脂降解，花生四烯酸代謝產物增多，其中有些物質具有很強的趨化作用，因而就能吸引大量白細胞進入組織或粘附于血管內皮，而白細胞本身又能釋放很多具有趨化作用的炎性介質，如白三烯之一的LTB 4 ,從而使微循環中白細胞進一步增加。
白細胞積聚對組織的損傷作用在于：
（一）嵌頓、堵塞毛細血管有助于形成無復流現象。微動脈及微靜脈亦有大量白細胞粘附于內皮細胞，雖不一定堵塞血流，但粘附的白細胞仍可損傷組織并釋放趨化因子從而吸引更多的細胞。
（二）白細胞可以增加血管通透性，水腫組織的含水量與白細胞密度呈正相關，說明白細胞可能引發水腫。白細胞增加血管通透性、引發水腫的機制與白細胞釋放的某些炎癥介質有關。
（三）激活的中性粒細胞釋放溶酶體酶，可使組織發生蛋白水解性破壞和液化。
（四）中性粒細胞可通過產生氧自由基而損傷組織。
白細胞在缺血再灌注損傷的作用，可被以下實驗結果證明：
1．用除去白細胞的血液進行再灌注，可以防止水腫產生并減輕再灌性損傷。
2．抗炎藥減輕組織白細胞浸泣，可縮小梗塞面積。實驗證明布洛芬（ibuprofen）對心肌具有保護作用，主要是由于抑制白細胞浸潤的作用所致。
3．用補體抑制藥降低補體，從而減少白細胞浸潤，可能減輕組織損傷。絲氨酸蛋白酶抑制藥，可以縮小心肌梗塞，而這種酶恰是一種在心肌缺血時能激活補體的酶。因此這種酶的抑制藥，可通過抑制補體的激活而抑制白細胞浸潤，從而減輕心肌損傷。
四、高能磷酸化合物的缺乏
心肌正常情況下以有氧代謝形式生成三磷酸腺苷（ATP）供作功需要。心肌缺血時則轉為無氧代謝為主，ATP合成減少，以致心舒縮功能障礙。在犬的實驗中證明，心肌嚴重缺血15分鐘（結扎冠狀動脈左旋支），心肌發生可逆性損傷。此時如果得到血液再灌注，則細胞并不死亡。但有很多報告指出，短時間缺血后，收縮功能長時間不能恢復。究其原因，多認為與ATP水平的低下有關。研究證明缺血15分鐘時不僅ATP減少60％。總腺苷酸池也減少50％。ADP也輕度減少（可能轉為ATP或AMP），AMP明顯升高，但其升高程度小于ATP減少輻度。再灌注20分鐘ATP明顯回升，但只接近正常的一半，再灌注24小時仍然維持在低水平上，只有在再灌注4天后ATP及總腺苷池才近于恢復，但仍低于非缺血區。
以大鼠離體作功心臟為模型（Neely氏模型），先在20℃低溫下給心臟停跳液，再短時間全心缺血（夾住主動脈）后，再灌注生理溶液。結果是給停跳液30分鐘再缺血30分鐘后，ATP幾乎完全喪失，ADP明顯減少，AMP明顯增加，總腺苷酸量顯著降低。再灌注60分鐘可使ATP明顯回升，但不及正常對照的一半，而總腺苷酸量則明顯低于給停跳液后，比正常對照減少50％。上述研究提示缺血及再灌注損傷的心肌有氧代謝性發生嚴重損傷，影響能量代謝及心肌功能的恢復。
再灌注時高能磷酸化合物之所以恢復慢且總腺苷酸水平明顯下降，可能與下列因素有關。
（一）缺血心肌的代謝障礙主要表現為對氧的利用能力受限，有氧代謝嚴重受損。在缺血進入不可逆階段再灌注時，氧的利用并不增加，心肌只能利用運至心肌的氧的17％。氧的利用能力受限與缺血及再灌注所致線粒體受損有關。
（二）ATP合成的前身物質（腺苷、肌苷、次黃嘌呤等）在再灌時被沖洗出去，使心肌失去再合成高能磷酸化合物的物質基礎。實驗證明在再灌注液中補充肌苷或谷氨酸能促進ATP的合成及心功能的恢復。
3.線粒體膜發生氧自由基誘發的脂質過氧化反應使線體受損。線粒體膜富有磷脂，線粒體在缺氧時又是產生自由基的場所，因此極易引起膜脂過氧化使線粒體功能障礙。
五、自由基的作用
自由基（free radical）是具有一個不配對電子的原子和原子團的總稱。由氧誘發的自由基稱為氧自由基或活性氧，如超氧陰離子（O 2 ）、羥自由基（OH?）及單線態氧（ 1 O 2 ，激發態放出一個光子）等非脂性自由基。H 2 O 2 非自身基，但也是一種氧化作用很強的活性氧。氧自由基與多聚不飽和脂肪酸作用后生成的中間代謝產物烷自由基（L?）、烷氧基（LO?）、烷過氧基（LOO?）等屬于脂性自由基。氧自由基和脂性自由基的性質極為活潑，易于失去電子（氧化）或奪取電子（還原），特別是其氧化作用強，故具有強烈的引發脂質過氧化的作用。在生理情況下，氧通常是通過細胞色素氧化酶系統接受4個電子還原成水，同時釋放能量，但也有1～2％的氧接受一個電子生成O 2， 或再接受一個電子生成H 2 O 2 。但由于細胞內存有超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（glrtathione peroxidase, GSH-PX）等抗氧化酶類可以及時清除它們，所以對機體并無有害影響。在病理條件下，由于活性氧產生的過多或抗氧化酶類活性下降，則可引發鏈式脂質過氧化反應損傷細胞膜系并進而使細胞死亡。
（一）細胞內氧自由基的生成
分子氧在線粒體細胞色素氧化酶系統中接受一個電子而被還原生成O 2 。
O 2 e- → O 2 -
這是其他活性氧產生的基礎。過氧化氫（H 2 O 2 ）及羥自由基（OH?）續發于此。即氧在獲得一個電子時還原生成O 2 - ，獲得2個電子生成H 2 O 2 ，獲得3個電子生成OH?,獲得四個電子生成H 2 O。
H 2 O 2 既可由O 2 - 自發歧化產生，也可經酶促歧化而生成。
H 2 O 2 本身并非自由基而是一種活性氧，它與氧自由基的產生有密切關系（詳下文）。
OH?自由基的產生不僅需要O 2 - 或H 2 O 2 ，而且要有過渡金屬，如鐵的螯合物的存在。由鐵催化的Fenton型Haber-Weiss反應可迅速形成OH?，而單純的Haber－W-eiss反應速度很慢，很難由此形成OH?。
O 2 - +H 2 O 2 →O 2 ＋OH - ＋OH?
(Haber－Weiss反應)
Fe（Ⅲ）＋O 2 - →fe(Ⅱ)＋O 2 （2）
Fe(Ⅱ)H 2 O 2 →Fe(Ⅲ)+OH - +OH??。?）
也就是說，O 2 - 使鐵還原，還原的鐵再使H 2 O 2 還原生成OH?，OH?是最活躍最強力的氧自由基。缺血與再灌注時氧自由基生成過多，其機制可能是：
1.黃嘌呤氧化酶的形成增多 黃嘌呤氧化酶（xanthine ocidase, XO）的前身是黃嘌呤脫氫酶（xanthine dehydrogenase, XD）。這兩種酶主要存在于毛細血管內皮細胞內。正常時只有10％以XO的形式存在，90％為XD。缺血時由于ATP減少，膜泵功能失靈，Ca 2+ 進入細胞激活Ca 2+ 依賴性蛋白水解酶，使XD大量轉變為XO。缺血時ATP不能用來釋放能量，而且還依次降解為ADP、AMP和次黃嘌呤，故在缺血組織內次黃嘌呤大量堆積。再灌注時，大量分子氧隨血液進入缺血組織，黃嘌呤氧化酶在催化次黃嘌呤轉變為黃嘌呤并進而催化黃嘌吟轉變為尿酸的兩步反應中，都同時以分子氧為電子接受體，從而產生大量的O 2 - 和H 2 O 2 ，后者再在金屬離子參與下形成OH?。因此，再灌注時組織內O 2 - 、OH?等氧自由基大量增加。
2.中性粒細胞 中性粒細胞在吞噬活動時耗氧量顯著增加，所攝取的O 2 絕大部分經細胞內的NADPH氧化酶和NADH氧化酶的作用而形成氧自由基，并用以殺滅病原微生物。如氧自由基產生過多或機體清除氧自由基的酶系統活性不足或抗氧化劑不夠時，中性粒細胞形成的氧自由基就可損害組織。
在再灌注時，由黃嘌呤氧化酶的作用所產生的氧自由基起原發的、主要的作用；這些自由基作用于細胞膜后產生的具有趨化活性的物質如LTB 4 等可吸引大量中性粒細胞到局部釋放氧自由基等物質而進一步損害組織。
3.線粒體 可能是由于缺氧使ATP減少，Ca 2+ 進入線粒體增多而使線粒體功能受損，細胞色素氧化酶系統功能失調，以致進入細胞內的氧，經單電子還原而形成的氧自由基增多而經4價還原而形成的水減少。細胞色素氧化酶的功能失調，也可能是缺氧時細胞內氧分壓降低的結果。
4.兒茶酚胺的增加 交感-腎上腺髓質系統是機體在應激時的重要調節系統。在各種應激包括缺氧的條件下，此系統分泌大量的兒茶酚胺，兒茶酚胺一方面具有重要的代償調節作用，但過多的兒茶酚胺特別是它的氧化產物，往往又成為對機體的有害因素。實驗證明，大量的異丙腎上腺素、去甲腎上腺素、腎上腺素均能引起細胞損傷。造成心肌損害的是兒茶酚胺的氧化產物，而非兒茶酚胺本身。兒茶酚胺氧化能產生具有細胞毒性的氧自由基。腎上腺素代謝產生緊上腺素紅的過程中有O 2 - 產生。
（二）自由基反應與再灌注損傷
機體在生命過程中所能遇到的自由基種類很多。因此很難概括其生物學反應。自由基參與一個反應系統后能形成新的自由基。因此自由基一旦形成，就成為自由基反應擴展程序的一部分，例如：
R?＋XH→RH＋H?
R?＋CCl 4 →RCl＋Cl 3 C?
另一個自由基反應則是自由基加入到不飽和鍵中去。如脂肪酸及芳香族環的不飽和鍵。
自由基反應既可經自由基中間代謝產物不斷向前發展，又可由細胞損傷而終止。自由基反應的擴展可以是無限的，但又可為各種自由基清除劑（free radical scavenger）所終止。
由于自由基有極為活潑的反應性，所以它們能和各種細胞成分（膜磷脂、蛋白、核酸）發生反應。
（1）膜脂：是構成膜脂質雙層的重要結構及功能成分，富含不飽和脂肪酸，自由基與不飽和脂肪酸作用引發脂質過氧化（lipid peroxidation）反應。脂質過氧化物的形成使膜受體、膜蛋白酶和離子通道的脂質微環境改變，從而改變它們功能，由于脂質過氧化反應的增強，細胞膜內多價不飽和脂肪酸減少，生物膜不飽和脂肪酸/蛋白質比例失常，膜的液態性、流動性改變，通透性增強。含雙鍵脂肪酸過氧化可生成丙二醛，它的產生與脂質過氧化相平行，因而測定丙二醛含量可代表脂質過氧化物的濃度。丙二醛能使膜成分之間形成交聯和聚合（polymerization），使膜的基本特性如變構、離子傳遞、酶活性等發生改變。
自由基可通過誘致過氧化而影響脂質，從而產生短鏈脂酰衍化物和副產物丙二醛。丙二醛反應可介導各種交聯反應。自由基也能催化氨基酸氧化、蛋白質-蛋白質交聯和蛋白質鏈的斷裂
（2）蛋白質：在自由基的作用下，胞漿及膜蛋白及某些酶可交聯成二聚體或更大的聚合物。這種交聯既可借助于蛋白質之間的二硫鍵形成也可由于自由基損傷的氨基酸殘基間的反應形成。蛋白質的交聯將使其失去活性，結構改變。
（3）核酸：自由基對細胞的毒性作用主要表現為染色體畸變，核酸堿基改變或DNA斷裂。80％是OH?的作用。OH?易與脫氧核糖及鹼基反應并使其改變。
（三）細胞對自由基損傷的防護
自由基的產生既然是有機體在正?；虿±項l件下的常見現象，因此在進化過程中也就形成了一系列對抗自由基，防止其損傷的系統。這種生化學防護系統主要有兩大類：低分子自由基清除劑及復合酶系統。
1.低分子清除劑 存在于細胞脂質部分的自由基清除劑有維生素E（α-生育酚）和維生素A（β-胡蘿卜素）；存在于細胞內外水相中的自由基清除劑有半胱氨酸、抗壞血酸和谷胱甘肽等，它們能提供電子使自由基還原，故有重要的防護作用。例如維生素E（生育酚）能還原O 2 - 、單線態氧（ 1 O 2 ）、過氧化脂質自由基等；抗壞血酸具有相同作用而且能協助生育酚維持其具有活性的還原狀態。β-胡蘿卜素是單線態氧（ 1 O 2 ）的有效清除劑并能抑制脂質過氧化。
胞漿中的還原型谷胱甘肽（GSH）與還原型輔酶Ⅱ（NADPH）在某些酶如過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶等的協同作用下，能還原H 2 O 2 、過氧化脂質、二硫化物及某些自由基。
2.酶性清除劑 細胞內有二種酶可以清除H 2 O 2 ，即過氧化氫酶和過氧化物酶。如所周知H 2 O 2 是OH?自由基的前身，上述兩酶可使H 2 O 2 濃度降低，從而避免高毒性OH?的產生。這兩個酶的細胞內分布，尚不清楚。
細胞內具有清除劑作用的另一個重要酶是超氧化物歧化酶（SOD）。它是一種金屬蛋白，可以歧化O 2 - 生成H 2 O 2 。哺乳類細胞含有兩種SOD。其一是位于胞漿中的CuZn 超氧化物歧化酶，另一是位于線粒體中的Mn超氧化物歧化酶。SOD作用的重要意義，在于清除H 2 O 2 及OH?的前身O 2 - ，從而保護細胞不受強毒性氧自由基的損傷。
清除劑的濃度及活性下降必將引起自由基所致之細胞損傷。
（四）自由基在缺血再灌注損傷機制中的地位
缺血/再灌注損傷機制中的各種學說，無一不與自由基的作用有關。
1.缺血/再灌注時脂質過氧化增強（自由基引發），組織及血漿中脂質過氧化物顯著增高，超微結構嚴重受損。給予抗氧化劑如：維生素E、硒（谷胱甘肽過氧化物酶輔基所含金屬）及SOD能顯著減輕缺血/再灌注損傷。
2.細胞膜脂質過氧化改變膜酶、離子通道的脂質微環境，從而使膜通透性增高，細胞外鈣離子內流。膜上Na + -K + -ATP酶失活，可使細胞內Na + 升高，Na + -Ca 2+ 交換增強。而使細胞內鈣超載。
3.線粒體膜富有磷脂，缺血/再灌注時自由基引發的線粒體膜脂質過氧化或細胞內形成脂質過氧化物作用于線粒體膜，使膜的液態及流動性改變，從而導致線粒體功能障礙，高能磷酸化物產生減少，自由基產生增多。細胞喪失能量貯備。依靠能量的質膜及肌漿網膜鈣泵，由于能量不足不能將肌漿中過多的Ca 2+ 泵出或吸收入肌漿網，致使肌細胞內Ca 2+ 濃度增加，加上由細胞外來的Ca 2+ 終于造成細胞內Ca 2+ 超載，成為細胞致死原因。
4.自由基引發的脂質過氧化造成細胞成分間的交聯（脂質-脂質交聯、蛋白-蛋白交聯、脂質-蛋白交聯、蛋白-膠原交聯），使整個細胞喪失功能。
5.缺血/再灌注時，微粒體及質膜上的脂加氧酶（lipoxygenase）及環加氧酶（cyclooxygenase）激活，催化花生四烯酸代謝，在加強自由基產生及脂質過氧化的同時形成具有高度生物活性的物質，如前列腺素、血栓素等。很多實驗證明，缺血特別是再灌注時血栓素形成增加，前列環素形成減少，因而造成微循環障礙，出現無復流現象。
總之，自由基即使不是缺血/再灌注損傷的唯一發病學因素，至少也是甚為重要的環節。
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