正常大兔膽囊上皮細胞的培養

實驗材料：

1.  2—3月齡的家兔膽囊；

2.  不含Ca²⁺ 和Mg²⁺ 的1×PBS，添加200000IU/L青霉素、200mg/L鏈霉素，pH7.2；

3.  培養用液：以DMEM/F12為基礎培養基，添加10%的胎牛血清、2 mmol/L谷氨酰胺、2μg/ml胰島素、10 ng/ml表皮生長因子以及100 IU/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素。酶消化液為0.125%Ⅳ型膠原酶溶液。組織清洗液為DMEM培養液，并添加200 IU/ml青霉素和200μg/ml鏈霉素；也可使用無Ca²⁺ 、Mg²⁺ 的D-Hanks液作為組織清洗液。

4.  培養器具：用鼠尾膠原或膠原蛋白包被的25ml培養瓶或24孔培養板、無菌普通培養皿若干。手術刀、眼科剪、鑷等；

實驗方法：

1.  選用2—3月齡的家兔，以戊巴比妥鈉麻醉，開腹取出肝臟并從中分離膽囊；

2.  排凈膽囊中的膽汁，將膽囊切開，用組織清洗液反復洗凈膽囊粘膜表面的膽汁和粘液；

3.  在普通培養皿底面滴加1—2ml的酶消化液，膽囊粘膜面朝下，與酶消化液相貼。置37℃下消化10—15min后，再將膽囊移入另一培養皿，粘膜面朝上，向上滴加10%胎牛血清DMEM/F12培養液，以終止消化；

4.  用眼科手術刀輕刮膽囊粘膜表面，一方面不斷地將培養液滴在粘膜表面，另一方面用吸管收集消化刮落的細胞；

5.  將收集到的含消化酶的細胞懸液離心（1000r/min，5—7min）沉淀細胞，棄上清液。再加培養液將調節細胞密度至4×10⁴ —5×10⁴ 個/ml；

6.  直接在培養瓶或板上種植。于37℃、5%CO₂ 的培養箱中培養。4—7d后，待細胞貼壁，再每3d更換培養液1次；

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