LDH（乳酸脫氫酶）法細(xì)胞毒性檢測(cè)

1. 原理：LDH (乳酸脫氫酶） 是穩(wěn)定的胞漿酶，存在所有的細(xì)胞中，當(dāng)胞膜損傷時(shí)快速釋放到細(xì)胞培養(yǎng)液中。 LDH 活性通過兩個(gè)酶催化反應(yīng)： LDH 氧化乳酸鹽生成丙酮酸鹽，然后丙酮酸鹽和四唑鹽 INT 反應(yīng)生成甲（ formazan ）結(jié)晶。

甲（ formazan ）結(jié)晶量在培養(yǎng)液中的增加，與裂解的細(xì)胞數(shù)增加直接相關(guān)。甲（ formazan ）結(jié)晶染料是水溶的，可以用分光光度計(jì)在 500nm 波長(zhǎng)檢測(cè)。

通過檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中 LDH 的活性，可判斷細(xì)胞受損的程度此分析靈敏、方便、精確，適用于許多種細(xì)胞毒性分析。此分析大概需 0.5 － 1h 。

2. 試劑：該檢測(cè)方法一般有配套的試劑盒，以400T的試劑盒為例，包括以下試劑：

3. 工作液的制備：

a. 用 ddH2 O 溶解催化劑（ Catalyst ） 10min ，充分混勻。催化劑溶液 4 ℃ 可保存數(shù)周。

b. 染色液（ Catalyst ） 4 ℃ 可保存數(shù)周。

c. 反應(yīng)混合液的制備：分析 100 assays ，混合 250ul 催化液和 11.25ml 染色液?；旌弦含F(xiàn)配現(xiàn)用。

4. 細(xì)胞毒分析步驟：

（ 1 ） 收集細(xì)胞，用 1× 分析液（如， 1 ％血清或 1 ％ BSA 培養(yǎng)液）。

（ 2 ） 在 96 孔板中分別制備下列樣本：

背景對(duì)照： 每孔加 200ul 培養(yǎng)液， 3 個(gè)復(fù)孔。背景值應(yīng)從其他值中減去。

低對(duì)照： 向每孔 200ul 分析液中加 1 － 2×104 細(xì)胞， 3 個(gè)復(fù)孔。

高對(duì)照： 向每孔 200ul 含 1 ％ Triton X-100 的分析液中加 1 － 2×104 細(xì)胞， 3 個(gè)復(fù)孔。

檢測(cè)樣本： 向每孔 200ul 含檢測(cè)物質(zhì)的分析液中加 1 － 2×104 細(xì)胞， 3 個(gè)復(fù)孔。

（ 3 ）在培養(yǎng)箱中（ 5 ％ CO2 ,90% 濕度， 37 ℃ ）孵育細(xì)胞，孵育時(shí)間為檢測(cè)物質(zhì)的適當(dāng)處理時(shí)間。

（ 4 ） 離心細(xì)胞 250g ， 10min 。

（ 5 ） 每孔小心轉(zhuǎn)移 100ul 上清到相應(yīng)的優(yōu)化清潔 96 孔板中。

（ 6 ） 每孔加入 100ul 反應(yīng)混合液，室溫孵育 30min 。避光操作。

（ 7 ） 用微孔讀板儀在 490 － 500nm 檢測(cè)所有樣本的吸光值。參考波長(zhǎng)大于 600nm 。

5. 計(jì)算細(xì)胞毒的百分比：

細(xì)胞毒（％）＝ （檢測(cè)樣本－低對(duì)照） / （高對(duì)照－低對(duì)照） %

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