CaCl2感受態細胞的制備

試劑準備：

LB培養基，50mL離心管4個，250mL搖瓶1個，1.5mL 離心管高壓滅菌

0.1M CaCl2高壓滅菌

含15%甘油的0.1M CaCl2：50%甘油、0.15M CaCl2高壓滅菌，1:2混合配制

制備步驟：

1．前夜接種受體菌（DH5α或DH10B），挑取單菌落（或直接用－80℃保存的單克隆菌液100μL）， 放入10mL LB培養基中37℃搖床培養過夜（約12~16小時）；

2．取1ml過夜培養物轉接于100ml LB培養基中，在37℃搖床上劇烈振蕩培養約2.5-3小時（250-300rpm），檢測OD550在0.6時最佳 (當OD550 在0.2時每20分鐘檢測一次)；

3．將0.1M CaCl2溶液置于冰上預冷；

以下步驟需在超凈工作臺和冰上操作

4．將100mL菌液分裝于4個50mL離心管，冰上冷卻10min；

5．4℃下3000g冷凍離心5min；

6．棄去上清，加入10mL預冷0.1M CaCl2溶液，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細胞重新懸浮，在冰放置30min~60min；

7．4℃下3000g冷凍離心5min；

8．棄去上清，加入含15%甘油的預冷0.1M CaCl2溶液5mL，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細胞重新懸浮，100μL/管冰上分裝至1.5mL 離心管中，封口并標記，－80℃貯存備用；

9．若直接用于轉化實驗，可不加甘油。

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