地高辛標記核酸探針的標記方法
核酸探針已被廣泛用于篩選重組克隆、基因多樣性的種性檢測和真菌種群內及種群之間的系統發育關系評價。
最早使用的放射性同位素標記核酸探針具有敏感性高、特異性好、分辨力強的特點，但放射性同位素標記也存在著一系列令人困擾的問題,如成本高、探針半衰期短、放射性物質危害人體健康等。
而且在進行放射性同位素標記實驗時,需要有專門的實驗室及相應的實驗保護設施，還需要由經過培訓的專業人員來操作,因而限制了在普通實驗室進行分子生物學實驗。
近幾年發展起來的非放射性核酸探針大多通過酶促、光化學和化學手段摻入一種報道基團,這種報道基團可通過高靈敏度的冷光、熒光或金屬沉淀等檢測系統檢測。
另外,應用pH電極或感應器技術的電化學檢測系統也有報道。
在這些檢測系統中,靈敏度最高的是生物素- 親合素檢測系統和半抗原-抗半抗原地高辛檢測系統。
由于生物樣品中常含有內源性生物素及生物結合蛋白，生物素標記的核酸探針會發生一些非特異性結合，從而影響實驗效果。
與生物素-親合素系統同樣具有高靈敏度，卻減少了非特異性結合的地高辛檢測系統，已為人們所接受,并得到廣泛的應用。
地高辛(Digoxigenin ,DIG) 又稱異羥基洋地黃毒甙元，是一種類固醇半抗原分子。
采用人工方法可以將地高辛的線型間隔臂與dUTP 連接起來,形成DIG-11-dUTP，通過隨機引物法或PCR法將其摻入到DNA探針中。
RNA探針的標記是使用噬菌體信息編碼的RNA聚合酶，通過體外轉錄將DIG-11-dUTP摻入到RNA探針中。
寡核苷酸探針的標記則是通過末端轉移酶催化，在3'末端加上DIG-11-dUTP/dATP 或DIG-11-ddUTP 尾巴。
對于目的DNA 或RNA 來說，分子雜交后,雜交部分可通過ELISA 實驗程序加以檢測，即加入一種結合有堿性磷酸酶的地高辛-特異性抗體，它與地高辛半抗原分子形成酶聯抗體-半抗原(DIG) 復合物，再加入相應的顯色底物，使雜交部分得以顯示。
1 地高辛標記核酸探針的主要標記方法
1. 1 DNA 探針的標記方法
1. 1. 1 PCR 摻入法
這種標記方法是通過聚合酶鏈式反應，在Taq 酶的作用下，將DIG-11-dUTP 摻入到新合成的DNA 鏈中。
以本法標記的探針不但靈敏度高，產量也很高。
少量的基因組DNA(1ng～50ng) 便可直接通過PCR 進行擴增、標記。
1. 1. 2 隨機引物法
用隨機引物法可將DIG-11-dUTP 標記于DNA 鏈上。
為得到最佳標記效果，標記前模板DNA 需作線性處理，而且至少要用苯酚-氯仿進行一次抽提，再用乙醇沉淀。
100～10000 堿基的模板鏈均可被有效地標記，但大于10000 堿基的模板鏈則需要在標記前作限制酶切消化。
處理好的模板加入隨機引物，按堿基互補原則，隨機引物與模板DNA 退火后由Klenow 片段從引物3' 端延伸引物，便可將DIG-11-dUTP 均勻摻入到新合成的DNA 鏈中。
1. 1. 3 切口平移法
切口平移法DNA 探針技術快速簡便，且已非常成熟。
先用適量的DNase I 在雙鏈DNA 上打開若干個單鏈缺口，然后在E. coli DNA 聚合酶I 的5'- 3' 外切活性和聚合活性的共同作用下，在缺口的5' 端切除單鏈DNA 序列，隨之由新合成的帶有地高辛標記的脫氧核苷酸鏈取代。
本法適用于環形DNA 或大于1kb DNA 片段的標記。
用于原位雜交的核酸探針，通過切口平移法標記最為有效。
因為此方法可通過控制DNase I 的酶活性得到適當的缺口，從而得到長度大小適宜的探針，而探針的大小是原位雜交的一個重要參數，足夠小的探針才可能穿透組織或細胞。
1. 2 寡核苷酸探針的標記方法
合成的寡核苷酸探針被廣泛應用于篩選基因文庫、Southern 印跡、Northern印跡、斑點印跡及原位雜交試驗。
地高辛標記寡核苷酸有三種方法:3' 末端標記、5' 末端標記以及在探針3' 端加上數個DIG-11-dUTP 分子的尾巴 。
1. 2. 1 3' 末端標記法
3' 末端標記法的主要特點是在每個合成的寡核苷酸(長度為14～100bp) 的3' 末端只添加一個地高辛殘基(DIG-ddU TP)。
用此方法標記寡核苷酸時,除末端轉移酶外,無需其它特別的寡核苷酸合成試劑,方便快捷。
所合成的探針適合于要求探針具有較高的特異性而靈敏度一般的試驗,如Southern 印跡、Northern 印跡、斑點印跡及菌落P噬菌斑雜交實驗。
1. 2. 2 5' 末端標記法
5' 末端標記法是通過化學方法將地高辛標記于寡核苷酸的5' 末端。
首先在5' 末端連接上一個氨基連接臂殘基,將合成的寡核苷酸純化后,再使DIG-NHS 與5' 末端的氨基殘基發生共價結合,從而形成標記探針。
這類探針的一個主要優點是其3' 端在DNA 合成反應中充當引物,使反應產物得以標記。
1. 2. 3 3' 末端加尾法
3' 末端加尾法是由末端轉移酶在探針3' 末端加上數個地高辛殘基的尾巴。
此方法標記的探針靈敏度較3' 末端標記法要高出10 倍左右,但由于存在長尾巴,往往會出現較嚴重的非特異性背景。
1. 3 RNA 探針的標記方法
通過RNA 聚合酶SP6 、T7 或T3 經體外轉錄可將地高辛標記于RNA 探針上。
用地高辛標記的RNA 探針具有很強的信號能力,且非特異性背景少,在Southern 印跡和Northern 印跡實驗中,效果明顯優于同為地高辛標記的DNA 探針,可與放射性同位素標記探針相媲美。
另外,在篩選菌落P噬菌斑及原位雜交的實驗中,RNA 探針也同樣具有良好的效果。
而且,由于DIG與UTP之間的鍵合對堿性不敏感,可通過堿處理方法得到所需大小的探針。
2 影響探針標記方法選擇的因素
使用地高辛系統時,可根據地高辛系統的不同用途、所獲得的用以制備探針的模板類型、以及探針可達到的靈敏度,選擇探針標記方法。
總體而言,DNA 模板的純度越高,標記的效率也越高。
在進行標記前,應使用苯酚、氯仿抽提DNA 模板。此外,對于隨機引物標記DNA 的方法而言,在標記反應之前,先將模板線性化并加熱變性是至關重要的;而對寡核苷酸來說,在其3' 末端加上DIG-11-dUTP 的尾巴前,應該先經過凝膠或HPLC 純化。
3 雜交技術
使用地高辛標記的核酸探針進行分子雜交,其雜交動力學、雜交條件與放射性同位素標記的探針相似。
探針的性質不同,雜交溫度和時間也不同:DNAP不含甲酰胺:雜交溫度為68 ℃,時間≥6h ;DNAP含50 %甲酰胺:雜交溫度為42 ℃,時間≥6h ;寡核苷酸P不含甲酰胺:雜交溫度為54 ℃,時間1～6h ;RNA - RNA 雜交(RNA 探針) :雜交溫度為68 ℃,時間≥6h ;RNA - DNA雜交(DNA 探針) :雜交溫度為50 ℃,時間≥6h 。
地高辛標記探針的一個最重要的優點就是穩定性很強。
分子雜交后,雜交液中仍舊含有大量沒有退火的地高辛標記探針,只要將這些剩余溶液倒回塑料試管中,分別在- 20 ℃(DNA探針) 和- 70 ℃(RNA 探針) 妥善儲存,其穩定性至少可以保持一年之久。
在使用這些探針時只需解凍后加熱至95 ℃,變性10min 即可。如果雜交液中含有甲酰胺,則需68 ℃變性10min。
此外,在雜交這一環節中,為了避免探針濃度過高而產生干擾背景,有必要在正式雜交前先進行一次模擬雜交,以篩選最適的濃度。
4 地高辛標記探針的顯色檢測
4. 1 化學發光檢測
化學發光檢測能通過X 光片記錄下很輕微的信號,其檢測過程分四個步驟完成。
首先使用封閉劑對雜交后的膜進行處理,以阻止抗體對膜的特異性吸引,然后加入結合有堿性磷酸酶的抗地高辛半抗原的抗體(Anti-DIG-AP) ,形成酶聯抗體- 半抗原復合物,再加入化學發光底物CSPD 或CDP-StarTM(Boehringer Mannheim 公司的產品) ,使其與膜上的雜交探針所結合的抗體復合物充分反應,最后在X 光片上曝光,以記錄化學發光信號。化學發光檢測在尼龍膜上的效果優于在纖維素膜上的效果。
4. 2 化學顯色
化學顯色同化學發光檢測的顯色原理相同，都是通過類似ELISA 實驗的程序加以檢測，不同的是化學顯色加入的顯色底物是5-溴-4-氯-3 吲哚酚磷酸鹽(也稱X-磷酸鹽，BCIP) 和氮藍四唑鹽(NBT)，它與酶聯抗體- 半抗原(DIG) 復合物在酶促作用下發生反應，于數分鐘內開始呈現藍紫色，隨時間延長，顏色逐漸變深，通常于24h 終止反應。
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