核酸含量測定—紫外分光光度法
【 實驗目的 】
學習紫外分光光度法測定核酸含量的原理和操作方法
【 實驗原理 】
核酸、核苷酸及其衍生物都具有共軛雙鍵系統，能吸收紫外光，RNA和DNA的紫外吸收峰在260nm波長處。
一般在260nm波長下，每1ml含1μg RNA溶液的光吸收值為0.022~0.024，每1m1含1μg DNA溶液的光吸收值約為0.020，故測定未知濃度RNA或DNA溶液在260nm的光吸收值即可計算出其中核酸的含量。
此法操作簡便，迅速。若樣品內混雜有大量的核苷酸或蛋白質等能吸收紫外光的物質，則測光誤差較大，故應設法事先除去。
【 實驗材料 】
1.實驗器材
離心機, 離心管,外分光光度計；
2.實驗 試劑
(1)鉬酸氨—高氯酸 試劑 (沉淀劑)：如配制200ml，可在193ml蒸餾水中加入7ml高氯酸和0.5g鉬酸氨。
(2)5%~6%氨水
【 實驗操作 】
1．用分析天平準確稱取待測的核酸樣品500mg，加少量蒸餾水調成糊狀，再加入少量水稀釋。然后用5%~6%氨水調至pH7加蒸餾水定容到50ml。于紫外分光光度計上測定260nm光吸收值，計算核酸濃度：
式中，A260——260nm波長處光吸收讀數；
L——比色皿的厚度，1cm；
N——稀釋倍數
2．如果待測的核酸樣品中含有大分子核酸，需加鉬酸氨—高氯酸沉淀劑，沉淀除去，測定上清液260nm波長處A值作為對照。
取兩支 離心管 ，向第一支管內加入2m1樣品溶液和2m1 蒸餾 水，向第二支管內加入2m1樣品溶液和2m1沉淀劑(以除去大分子核酸)作為對照。
混勻，在冰浴中放置，30min后離心(3000rpm)，從第一、第二管中分別吸取0.5m1上清液，用 蒸餾 水定容到50m1。
用光程為lcm的石英比色杯于260nm波長處測其光吸收值(A l 和A 2 )。
計算核酸濃度：
【 實驗結果討論 】
蛋白質由于含有芳香族 氨基酸 ，因此也能吸收紫外光。
通常蛋白質的吸收高峰在280nm處，在260nm處的吸收值僅為核酸的十分之一或更低，故核酸樣品中蛋白質含量較低時對核酸的紫外測定影響不大。
RNA在260nm與280nm處的吸收比值在2.0以上，DNA的比值>1.8；當樣品中蛋白質含量較高時比值即下降。
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