馬鈴薯多酚氧化酶制備及性質實驗
一、實驗目的
1. 學習從組織細胞中制備酶的方法。
2. 掌握多酚氧化酶的作用及各種因素對其作用的影響。
二、實驗原理
多酚氧化酶是一種含銅的酶，其最適pH值為6～7。由多酚氧化酶催化的反應，如以鄰苯二酚為底物，可以被氧化形成鄰苯二醌。由多酚氧化酶催化的氧化還原反應可通過溶液的顏色的變化鑒定，這個反應在自然界中是常見的，如去皮的馬鈴薯和水果變成褐色就是由于該酶作用的結果。
多酚氧化酶的最適底物是鄰苯二酚(兒茶酚)。間苯二酚和對苯二酚與鄰苯二酚的結構相似，它們也可以被氧化為各種有色物質。
酶是生物催化劑，其催化活性易受各種因素的影響，如溫度、pH、底物種 類、底物濃度、酶濃度以及抑制劑和蛋白質變性劑等都會改變其生物催化活性。
三、實驗器材
1.勻漿機
2.小刀，紗布，漏斗，其它玻璃器皿
3.離心機
4.冰箱
5.恒溫水浴
四、材料與試劑
1.馬鈴薯
2.0.1mol/L的NaF溶液: 將4.2g氟化鈉溶于1000mL水中。
3.0.01mol/L的鄰苯二酚溶液:將1.1g鄰苯二酚溶解于1000mL水中,用稀NaOH調節溶液的pH值為6.0,防止其自身的氧化作用。當溶液變成褐色時，應重新配制。新配制的溶液應貯存于棕色瓶中。
4.pH6.8的磷酸鹽緩沖液
5. 5%三氯乙酸溶液
6. 硫脲
7. 0.01mol/L的間苯二酚溶液:將0.11g間苯二酚溶解于100mL水中。
8.0.01mol/L的對苯二酚溶液:將0.11g對苯二酚溶解于100mL水中。
9.固體硫酸銨
10.0.8%HCl：19.2mL濃HCl加水稀釋到1000mL。
11.0.2%和0.3%(V/V)的乳酸溶液。
12. 0.5%的碳酸鈉溶液
13.0.01%的碳酸鈉溶液
五、操作方法
1.多酚氧化酶的制備
每三個小組一起，稱取150g馬鈴薯(新馬鈴薯可以不去皮)，切塊后放入勻漿機，加入150mLNaF溶液，勻漿后用四層紗布過濾。
各組分別量取50mL濾液置離心管中，于3500轉/min離心5～10min，取上清夜，加入固體硫酸銨16g，溶解，于4℃放置30min，于3500轉/min離心15min，倒掉上清液，沉淀用15mL pH6.8的磷酸鹽緩沖液溶解，即為粗酶液，含有馬鈴薯多酚氧化酶。
2.多酚氧化酶的催化作用
按表1加入各試劑，觀察反應現象并記錄和分析原因。
表1 多酚氧化酶的催化作用
| 試管號 | 酶液 | 鄰苯二酚 | 水 | 混勻后37℃保溫5～10min，觀察顏色變化 |
| 1 | 15滴 | 15滴 | － | |
| 2 | 15滴 | － | 15滴 | |
| 3 | － | 15滴 | 15滴 |
3. 多酚氧化酶的化學性質
按表2加入各試劑，觀察反應現象并記錄和分析原因。
表2 多酚氧化酶的化學性質
| 試管號 | 酶液 | 5％三氯乙酸 | 硫脲 | 振蕩混勻后分別加入鄰苯二酚15滴，于37℃保溫10min，觀察顏色變化 |
| 1 | 15滴 | － | － | |
| 2 | 15滴 | 15滴 | － | |
| 3 | 15滴 | － | 少許 |
4.底物專一性
按表3加入各試劑，觀察反應現象并記錄和分析原因。
表3 多酚氧化酶的底物專一性
| 試管號 | 酶液 | 鄰苯二酚 | 間苯二酚 | 對苯二酚 | 混勻后37℃保溫5～10min，觀察顏色變化 |
| 1 | 15滴 | 15滴 | － | － | |
| 2 | 15滴 | － | 15滴 | － | |
| 3 | 15滴 | － | － | 15滴 |
5.底物濃度的影響
按表4加入各試劑，觀察反應現象并記錄和分析原因。
表4 底物濃度的影響
| 試管號 | 酶液 | 鄰苯二酚 | 水 | 混勻后37℃保溫1min，觀察顏色變化 |
| 1 | 5滴 | 1滴 | 39滴 | |
| 2 | 5滴 | 10滴 | 30滴 | |
| 3 | 5滴 | 40滴 | － |
6.酶濃度的影響
按表5加入各試劑，觀察反應現象并記錄和分析原因。
表5 酶濃度的影響
| 試管號 | 酶液 | 鄰苯二酚 | 水 | 混勻后37℃保溫2min，觀察顏色變化 |
| 1 | 15滴 | 15滴 | － | |
| 2 | 1滴 | 15滴 | 14滴 |
1. 氫離子濃度的影響
按表6加入各試劑，觀察反應現象并記錄和分析原因。
| 管號 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 0.8% HCl | 40滴 | - | - | - | - |
| 0.3% 乳酸 | - | 40滴 | - | - | - |
| 0.2% 乳酸 | - | - | 40滴 | - | - |
| 0.01%碳酸鈉 | - | - | - | 40滴 | - |
| 0.5%碳酸鈉 | - | - | - | - | 40滴 |
| 鄰苯二酚 | 7滴 | 7滴 | 7滴 | 7滴 | 7滴 |
| 酶液 | 7滴 | 7滴 | 7滴 | 7滴 | 7滴 |
| 混合后pH值 | 1 | 3 | 5 | 7 | 9 |
| 37℃保溫5min，觀察顏色變化,確定最適pH值 |
六、思考題
1.在酶制備過程中加入硫酸銨的目的是什么?
2.在多酚氧化酶性質實驗中三氯乙酸和硫脲有什么作用?
3.該多酚氧化酶的最適pH值是多少?為什么?
4.通過實驗可知哪些因素會影響酶的催化活力?
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