肝組織中核酸的分離與鑒定
【 實驗目的】
1 ．掌握 DNA 分離純化的原理和方法。
2 ．熟悉臺式離心機 的使用。
3. 掌握 DNA 定量技術。
【 實驗原理】
細胞內的核酸多以核蛋白的形式存在，其中脫氧核糖核蛋白主要存在于細胞核 中，核糖核蛋白主要存在于細胞質中。這兩類核蛋白在 0.14mol ／ L 氯化鈉溶液中的溶解度相差很大，核糖核蛋白在此溶液中具有很高的溶解度，脫氧核糖核蛋白的溶解度卻相當低。制成肝勻漿后，用 0 ． 14mol ／ L 氯化鈉溶液抽提，可將兩種核蛋白分離。分離過程中加入少量檸檬酸鈉，可抑制脫氧核糖核酸酶對 DNA 的水解作用。
SDS( 十二烷基硫酸鈉 ) 能使脫氧核糖核蛋白產生解聚作用，在含有脫氧核糖核蛋白的溶液中加入 SDS ， DNA 即與蛋白質分離開，用氯仿將蛋白質沉淀除去，而 DNA 溶解于水相，最后用冷乙醇將 DNA 析出，而獲得純化的 DNA 。在氯仿中加入少量異戊醇能減少操作過程泡沫的產生，并有助于分相，使離心后的上層水相，中層變性蛋白，下層有機溶劑相維持穩定。 DNA 和 RNA 在波長 260nm 處有很高的吸收峰值，蛋白質則在 280nm 處有很高的吸收峰值。
利用這個原理，測定純化樣品在 260nm 和 280nm 處的吸光度，可以推算出樣品中 DNA 的濃度，并判斷其純度。在標準條件下，當 A260 ＝ 1 時，樣品中雙鏈 DNA 濃度為 50 μg/ml ，單鏈 DNA 濃度為 40 μg/ml 。純凈的 DNA 樣品 A260/A280 的比值約為 1.8 ，樣品中含有蛋白質或其它雜質，會使 A260/A280 的比值下降。
【 器材和試劑】
1. 器材 玻璃勻漿器、離心機 、試管、刻度吸管、紫外可見分光光度計
2. 試劑
1. 0.9 ％氯化鈉溶液
2. 10 ％氯化鈉溶液
3. 0.14 mol/L 氯化鈉溶液 ( 含 0.01 mol/L 檸檬酸鈉 ) ：稱取氯化鈉 8.182g 和檸檬酸鈉 2H2O 2.941g ，用蒸餾水溶解并稀釋至 1000m 1
4. 95 ％乙醇溶液 ( 冷藏 )
5. 5 ％十二烷基磺酸鈉 (SDS) 溶液 : 稱取 25 克 SDS 溶于 500m 1 45 ％乙醇
6. 氯仿 - 異戊醇混合液：氯仿 : 異戊醇 =24:1
7. 0.1 mol/L NaOH
【 操作步驟】
1 ．肝勻漿制備：新鮮豬肝，用 0.9 ％ NaCI 洗去血液，除去結締組織，剪碎，稱取 4g 肝組織，加 4ml 0.14mol ／ L NaCl 溶液，勻漿器中研磨，制成肝勻漿。
2 ．分離核蛋白：肝勻漿倒入試管中， 4000r/min 離心 5min ，上清棄去。沉淀加 2 m 1 0.14 mol/L NaCl 攪勻后再置勻漿器中研磨， 4000r/min 離心 5min ，上清棄去，沉淀重復上述操作，上清棄去，沉淀為 DNA- 蛋白質復合物。
3 ．沉淀中加 0.14mol/L NaCl 2.0ml ，攪勻，滴加 5 ％ SDS 2.0m1 ，邊加邊攪， 60 ℃ 水浴 10 min( 不停攪拌 ) ，冷至室溫，均勻分成兩管為 Bl 、 B2 。
4 ． B1 、 B2 管中各滴加氯仿 - 異戊醇液 4.0m 1( 邊加邊攪 ) ，攪至溶液顏色均勻， 3000r/min 離心 15min 。溶液分三層，上層液為水相 ( 含 DNA) ，中層為蛋白質沉淀，下層為有機相，吸取 B1 、 B2 上層液合倒于另一試管中。
5 ．上清液加 95 ％冷乙醇 4.0m 1 ，混勻 ( 顛倒混勻法 ) ， 3000r/min 離心 15min ，去上清液，沉淀為純化 DNA 。
6 ． DNA 的溶解：沉淀中加入 0.1 mol/L NaOH 4.0ml ，攪拌溶解， 2000r/min 離心 10min ，上清液則為 DNA 水解液。
7 ． DNA 的測定：用 0.1mol/L NaOH 將樣品稀釋到一定濃度，以 0.1mol/L NaOH 調零，測定樣品的 A260 和 A280 ，計算出每克肝組織中的 DNA 含量，并判斷純化 DNA 的純度。
【 注意事項】
1 ．在制備肝勻漿時，應盡量在冰冷條件下進行，并盡快加入含 0.0l mol ／ L 檸檬酸鈉的 0.14mol/L 氯化鈉溶液，以抑制脫氧核糖核酸酶 ，防止 DNA 的分解，以提高核酸得量。
2 ．各步驟操作應力求準確，盡量減少中途核酸的丟失，保證定量測定的準確性。
3 ．稀釋后應該盡量使樣品 A260 和 A280 處于 0.1-0.7 的范圍內。
二、肝組織中 RNA 的分離與鑒定
【 實驗目的】
1 ．掌握 RNA 分離純化的原理及操作方法
2 ．掌握 RNA 定量技術
【 實驗原理】
根據前面所述， DNA 和 RNA 這兩類核蛋白在 0.14mol ／ L 氯化鈉溶液中的溶解度不同，制成肝勻漿后，用 0.14mol ／ L 氯化鈉溶液抽提，可將兩種核蛋白分離 。在含有核糖核蛋白的 0.14mol ／ L 氯化鈉溶液中，調節 pH 至 4.2 ，使其達到等點電，核糖核蛋白即從溶液中沉淀出；用熱的 10 ％氯化鈉溶液抽提核糖核酸，最后用冷乙醇將核糖核酸鈉析出，而獲得純化的 RNA 。
分離過程中注意 RNase 的活性，防止 RNA 的降解。 RNase 無處不在，且耐高溫， RNA 的提取條件比 DNA 要嚴格得多，常采用 DEPC( 焦碳酸二乙酯 ) 來抑制 RNase 的活性。樣品中 RNA 的濃度及純度測定，與前相同，在此不再贅述，純度較高的 RNA 樣品， A260/A280=1.8 ～ 2.0 ，如果 A260/A280 ＜ 1.8, 說明樣品中含有蛋白質等，可用苯酚 - 氯仿抽提除去。
【 器材和試劑】
1. 器材 玻璃勻漿器、離心機、紫外可見分光光度計、試管、刻度吸管
2. 試劑
(1) 0.9 ％氯化鈉溶液
(2) 10 ％氯化鈉溶液
(3) 0.14mol ／ L 氯化鈉溶液 ( 含 0.01 mol ／ L 檸檬酸鈉 ) ：稱取氯化鈉 8.182g 和檸檬酸鈉 ·2H2O 2.941g ，用蒸餾水溶解并稀釋至 1000m 1
(4) 10 ％乙酸溶液
(5) 95 ％乙醇溶液 ( 冷藏 )
(6) 0.1mol/L NaOH
【 操作步驟】
1 ．肝勻漿制備：新鮮豬肝，用 0.9 ％ NaCl 洗去血液，除去結締組織，剪碎，稱取 4g 肝組織，加 4m 1 0.14mol/L NaCl 溶液，勻漿器中研磨，制成肝勻漿。
2 ．分離核蛋白：肝勻漿倒入試管中， 4000r/min 離心 5min ，上清倒入另一試管中為 A 管。沉淀加 2m 1 0.14mol ／ L NaCI 攪勻后再置勻漿器中研磨， 4000r/min 離心 5min ，上清倒入 A 管，沉淀重復上述操作，上清并入 A 管，沉淀棄去。
3 ． A 管用 10 ％乙酸調 pH 至 4.2 ，混勻，靜置 5min ， 4000r/min 離心 5min ，傾去上清，沉淀含核糖核蛋白。
4 ． A 管沉淀中加 3m 1 10 ％ NaCI ，攪勻， 100 ℃ 水浴 10min( 不斷攪拌，防沸溢出 ) ，冷卻， 4000r/min 離心 5min ，留上清液。
5 ． A 管上清液加 95 ％冷乙醇 5m 1 ，見乳白色核糖核酸鈉沉淀，混勻放置 10min ， 4000r/min 離心 15min ，沉淀為純化 RNA 。
6 ． RNA 的溶解：沉淀中加入 0.1 mol/L NaOH 4.0ml ，攪拌溶解， 2000r/min 離心 10min ，上清液則為 RNA 水解液。
7 ． RNA 的測定：用 0.1mol/L NaOH 將樣品稀釋到一定濃度，以 0.1mol/L NaOH 調零，測定樣品的 A260 和 A280 ，計算出每克肝組織中的 RNA 含量，并判斷純化 RNA 的純度。
【 注意事項】
1 ．在制備肝勻漿時 , 在進行。在冰浴中進行，全部操做過程注意抑制 RNase 活性。
2 ．各步驟操作應力求準確，盡量減少中途核酸的丟失，保證定量測定的準確性。
3 ．稀釋后應該盡量使樣品 A260 和 A280 處于 0.1-0.7 的范圍內。
【 思考題】
1. 分離 RNA 時為何使用濃鹽 ?
2. 如何判斷所提取的 DNA 的純度 ?
3. 分離純化 DNA 時通常使用什么試劑
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