質粒DNA提取
① 加入solution.lll，經10min離心后細菌為什么不結實，有的漂浮在液面，有的貼在離心管壁上，一搖晃就破碎脫落下來？
細菌的用量太少，導致產生的沉淀主要是鹽分的沉淀，因為缺少變性的細菌蛋白和細菌基因組DNA的纏繞，沉淀就顯得不結實。
解決方法：增加細菌的用量。
② 加入soln.lll后，經10min離心后細菌沉淀為什么不結實，呈大塊的水泡狀并且上清較少？
（1）使用了過多的細菌，導致菌體未被有效裂解。
解決方法：減少細菌用量（減半）。
（2）細胞懸浮不充分，存留小菌塊，導致菌體未被有效裂解。
解決方法：注意將細菌懸浮充分。
（3）加Solution lll后中和不充分。
解決方法：如果細菌用量較多，注意多翻轉幾次直至中和后的沉淀呈松散的豆腐花狀（也可以稍微用力混合直至沉淀呈松散的豆腐花狀）。
（4）Solution ll出現沉淀。
解決方法：如果實驗室內溫度低于15℃，使用試劑盒前要注意觀察Solution ll中是否出現沉淀。如果出現沉淀，要在37℃水浴溶解沉淀后再使用。
（5）Solution ll長時間暴露于空氣中被被CO?中和，導致菌體未能被有效裂解。
解決方法：可以用經典堿裂解法抽提質粒DNA方法中的ll液替代Solution ll使用。
③ 出現嚴重的RNA污染。
（1）未在Solution l中事先加入RNase A1。
解決方法：補加RNase A1。
（2）加入RNase A1的Solution l長期保存于室溫，導致RNase A1活性下降。
（3）細菌過量，RNase A1不能有效降解RNA。
解決方法：將細菌用量減半或增加RNase A1在Solution l中的濃度。
④ 抽提的質粒DNA電泳時為什么會出現切口、斷裂或是降解現象？
（1）使用的是收集后冷凍保藏的細菌。
解決方法：使用新鮮培養的細菌。
（2）宿主菌富含核酸內切酶。
解決方法：增加一步Rinse A洗滌步驟以徹底去除殘留的核酸內切酶。或者將質粒DNA進行乙醇沉淀。
（3）質粒DNA在Solution ll中暴露過久，易造成質粒DNA的切口斷裂，裂解步驟應控制在5min內完成。
（4）培養的細菌被雜菌污染。
解決方法：重新挑取單菌落培養細菌。
⑤ 抽提的質粒DNA電泳時為什么會出現基因組DNA的污染？
（1）菌體裂解和中和過程中，劇烈混合造成基因組DNA斷裂所致。
解決方法：溫和地進行菌體地裂解和中和。
（2）加Solution ll時操作時間過長，造成基因組DNA斷裂所致。
解決方法：將裂解步驟控制在5min內完成。
（3）細菌的質量差（反復凍融的細菌、陳舊的細菌、培養條件不合適的細菌等）中有許多斷裂或降解而游離的基因組DNA。
解決方法：使用生長良好的新鮮細菌。
⑥ 加樣時DNA飄出加樣孔外。
忽略或省略了高速離心以甩干殘留的Rinse B的操作步驟。
解決方法：按說明書的操作步驟操作以確保殘留的Rinse B被甩干。
⑦ 質粒為什么會丟失？
細胞培養不要超過16小時，否則細菌會崩潰，引起細菌大量死亡，導致質粒丟失。有些質粒本身不能在某些菌種中穩定存在，經多次轉接后有可能造成質粒丟失。因此不要頻繁轉接，每次接種時應接種單菌落。另外，檢查篩選用抗生素使用濃度是否正確。
⑧ 大腸桿菌老化。
解決方法：涂布平板培養后，重新挑選新菌落進行液體培養。
⑨ 質粒拷貝數低。
由于使用低拷貝數載體引起的質粒DNA提取量低，可以更換具有相同功能的高拷貝數載體。
⑩ 菌體中無質粒。
有些質粒本身不能在某些菌種中穩定存在，經多次轉接后有可能造成質粒丟失。例如，柯斯質粒在大腸桿菌中長期保存不穩定，因此不要頻繁轉接，每次接種時應接種單菌落。另外，檢查篩選用抗生素使用濃度是否正確。
? 堿裂解不充分。
使用過多菌體培養液，會導致菌體裂解不充分。
解決方法：可減少菌體用量或增加(以天根生化的質粒小提試劑盒中的溶劑配置為例)溶液 P1、P2 和 P3 的用量。對低拷貝數質粒，提取時可加大菌體用量并加倍使用溶液P1、P2 和 P3，可以有助于增加質粒提取量和提高質粒質量。
? 溶液使用不當。
溶液 P2、P3 在溫度較低時可能出現渾濁。
解決方法：應置于 37℃ 保溫片刻直至溶解為清亮的溶液后才能使用。
? 吸附柱過載。
不同產品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的質粒量很大，就要分多次提取。若用富集培養基，例如 TB 或 2×YT，菌液體積必須減少；若質粒是非常高的拷貝數或宿主菌具有很高的生長率，則需減少 LB 培養液體積。
? 質粒未全部溶解（尤其是當質粒比較大的時候）。
解決方法：洗脫溶解質粒時，可適當加溫或延長溶解時間。
? 乙醇殘留。
解決方法：漂洗液洗滌后應離心盡量去除殘留液體，再加入洗脫緩沖液。
? 洗脫液加入位置不正確。
解決方法：洗脫液應加在硅膠膜中心部位以確保洗脫液會完全覆蓋硅膠膜的表面達到最大洗脫效率。
? 洗脫液不合適。
DNA 只在低鹽溶液中才能被洗脫，如洗脫緩沖液 EB(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA，pH8.0)或水。洗脫效率還取決于 pH 值，最大洗脫效率在pH 7.0-8.5 間。當用水洗脫時確保其 pH 值在此范圍內，如果pH過低可能導致洗脫量低。洗脫時將滅菌蒸餾水或洗脫緩沖液加熱至60℃后使用，有利于提高洗脫效率。
? 洗脫體積太小。
洗脫體積對回收率有一定影響。隨著洗脫體積的增大回收率增高，產品濃度降低，為了得到較高回收率可以增大洗脫體積。但也需要看質粒拷貝數，有濃度要求的洗脫體積就不能增大。
? 洗脫時間過短。
洗脫時間對回收率也會有一定影響。洗脫時放置 1 分鐘可達到較好的效果。
