質(zhì)粒細(xì)節(jié)
質(zhì)粒組成要素
一個(gè)合格的質(zhì)粒含有以下組成部分：
復(fù)制起始位點(diǎn) Ori 即控制復(fù)制起始的位點(diǎn)，原核生物 DNA 分子中只有一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)，而真核生物 DNA 分子有多個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)；
抗生素抗性基因 可以便于加以檢測(cè)，如 Amp+ 、Kan+；
多克隆位點(diǎn) MCS 克隆攜帶外源基因片段；
P/E 啟動(dòng)子/增強(qiáng)子；
Terms 終止信號(hào)；
加 poly（A）信號(hào) 可以起到穩(wěn)定 mRNA 作用。
如何閱讀質(zhì)粒圖譜
第一步：首先看 Ori 的位置，了解質(zhì)粒的類型（原核/真核/穿梭質(zhì)粒）。
第二步：再看篩選標(biāo)記，如抗性，決定使用什么篩選標(biāo)記。
Ampr 水解β－內(nèi)酰胺環(huán)，解除氨芐的毒性。
tetr 可以阻止四環(huán)素進(jìn)入細(xì)胞。
camr 生成氯霉素羥乙酰基衍生物，使之失去毒性。
neor（kanr）氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶 使 G418（長(zhǎng)那霉素衍生物）失活
hygr 使潮霉素β失活。
第三步：看多克隆位點(diǎn)（MCS）。它具有多個(gè)限制酶的單一切點(diǎn)。便于外源基因的插入。如果在這些位點(diǎn)外有外源基因的插入，會(huì)導(dǎo)致某種標(biāo)志基因的失活，而便于篩選。決定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。
第四步：再看外源 DNA 插入片段大小。質(zhì)粒一般只能容納小于 10Kb 的外源 DNA 片段。一般來說，外源 DNA 片段越長(zhǎng)，越難插入，越不穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化效率越低。
第五步：是否含有表達(dá)系統(tǒng)元件，即啟動(dòng)子－核糖體結(jié)合位點(diǎn)－克隆位點(diǎn)－轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。這是用來區(qū)別克隆載體與表達(dá)載體。克隆載體中加入一些與表達(dá)調(diào)控有關(guān)的元件即成為表達(dá)載體。選用那種載體，還是要以實(shí)驗(yàn)?zāi)康臑闇?zhǔn)繩。
啟動(dòng)子－核糖體結(jié)合位點(diǎn)－克隆位點(diǎn)－轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)
啟動(dòng)子－促進(jìn) DNA 轉(zhuǎn)錄的 DNA 順序，這個(gè) DNA 區(qū)域常在基因或操縱子編碼順序的上游，是 DNA 分子上可以與 RNApol 特異性結(jié)合并使之開始轉(zhuǎn)錄的部位，但啟動(dòng)子本身不被轉(zhuǎn)錄。
增強(qiáng)子/沉默子－為真核基因組（包括真核病毒基因組）中的一種具有增強(qiáng)鄰近基因轉(zhuǎn)錄過程的調(diào)控順序。其作用與增強(qiáng)子所在的位置或方向無關(guān)。即在所調(diào)控基因上游或下游均可發(fā)揮作用。/沉默子－負(fù)增強(qiáng)子，負(fù)調(diào)控序列。
核糖體結(jié)合位點(diǎn)/起始密碼/SD 序列（Rbs/AGU/SDs）：mRNA 有核糖體的兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)于原核而言是 AUG（起始密碼）和 SD 序列。
轉(zhuǎn)錄終止順序（終止子）/翻譯終止密碼子：結(jié)構(gòu)基因的最后一個(gè)外顯子中有一個(gè) AATAAA 的保守序列，此位點(diǎn) down－stream 有一段 GT 或 T 富豐區(qū)，這 2 部分共同構(gòu)成 poly（A）加尾信號(hào)。結(jié)構(gòu)基因的最后一個(gè)外顯子中有一個(gè) AATAAA 的保守序列，此位點(diǎn) down－stream 有一段 GT 或 T 富豐區(qū)，這 2 部分共同構(gòu)成 poly（A）加尾信號(hào)。
為什么質(zhì)粒圖譜上有的箭頭順時(shí)針有的箭頭逆時(shí)針，那其實(shí)是代表兩條 DNA 鏈，即質(zhì)粒是環(huán)狀雙鏈 DNA，它的啟動(dòng)子等在其中一條鏈上，而它的抗性基因在另一條鏈上。
如何選擇載體
把一個(gè)有用的基因（目的基因——研究或應(yīng)用基因）通過基因工程手段送到生物細(xì)胞（受體細(xì)胞），需要運(yùn)載工具（交通工具）攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞，這種運(yùn)載工具就叫做載體（vector）。
P.S. 基因工程所用的 vector 實(shí)際上是 DNA 分子，是用來攜帶目的基因片段進(jìn)入受體細(xì)胞的 DNA。
選擇載體主要依據(jù)構(gòu)建的目的，同時(shí)要考慮載體中應(yīng)有合適的限制酶切位點(diǎn)。如果構(gòu)建的目的是要表達(dá)一個(gè)特定的基因，則要選擇合適的表達(dá)載體。
載體的選擇主要考慮以下幾點(diǎn)：
1. 構(gòu)建 DNA 重組體的目的，克隆擴(kuò)增/表達(dá)表達(dá)，選擇合適的克隆載體/表達(dá)載體。
2. 載體的類型：
克隆載體的克隆能力－據(jù)克隆片段大小（大選大，小選小）。如<10kb 選質(zhì)粒。
表達(dá)載體據(jù)受體細(xì)胞類型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳類細(xì)胞表達(dá)載體。
對(duì)原核表達(dá)載體應(yīng)該注意 3 點(diǎn)：選擇合適的啟動(dòng)子及相應(yīng)的受體菌；用于表達(dá)真核蛋白質(zhì)時(shí)注意克服 4 個(gè)困難和閱讀框錯(cuò)位；表達(dá)天然蛋白質(zhì)或融合蛋白作為相應(yīng)載體的參考。
3. 載體 MCS 中的酶切位點(diǎn)數(shù)與組成方向因載體不同而異，適應(yīng)目的基因與載體易于鏈接，不產(chǎn)生閱讀框架錯(cuò)位。
選用質(zhì)粒（最常用）做載體的 4 點(diǎn)要求：
選分子量小的質(zhì)粒，即小載體（1－1.5 kb）→不易損壞，在細(xì)菌里面拷貝數(shù)也多（也有大載體）；
一般使用松弛型質(zhì)粒在細(xì)菌里擴(kuò)增不受約束，一般 10 個(gè)以上的拷貝，而嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒 < 10 個(gè)。
必需具備一個(gè)以上的酶切位點(diǎn)，有選擇的余地；
必需有易檢測(cè)的標(biāo)記，多是抗生素的抗性基因，不特指多位 Ampr。
無論選用哪種載體，首先都要獲得載體分子，然后采用適當(dāng)?shù)南拗泼笇⑤d體 DNA 進(jìn)行切割，獲得分子，以便于與目的基因片段進(jìn)行連接。
