引起基因工程菌質(zhì)粒不穩(wěn)定的原因

在重組菌分裂時(shí)，母細(xì)胞中的質(zhì)粒在兩個(gè)子代細(xì)胞中的分配往往是不均勻的，在極端情況下，其中一個(gè)子代細(xì)胞可能不含有質(zhì)粒。在質(zhì)粒中加入抗性標(biāo)記不但能用來篩選含質(zhì)粒細(xì)胞，而且也可以用于在培養(yǎng)過程中防止不含質(zhì)粒細(xì)胞的大量繁殖。例如，若質(zhì)粒上已經(jīng)含有卡那霉素抗性基因，就可以在培養(yǎng)基中加入一定濃度的卡那霉素，這樣，不含質(zhì)粒細(xì)胞無法生長，而含質(zhì)粒細(xì)胞的生長不受影響。另外，在質(zhì)粒構(gòu)建時(shí)應(yīng)該加入稱為 par和cer的位點(diǎn)，par位點(diǎn)能夠在細(xì)胞分裂過程中使質(zhì)粒分布更均勻，cer位點(diǎn)則能夠防止多聚體質(zhì)粒的形成，從而能從源頭上提高質(zhì)粒穩(wěn)定性。若細(xì)胞中所含質(zhì)粒數(shù)目較少，分裂時(shí)形成不含質(zhì)粒細(xì)胞的概率就會大大增加，因此一般推薦使用高拷貝質(zhì)粒。

工程菌培養(yǎng)的環(huán)境對質(zhì)粒穩(wěn)定性也有很大的影響，溶氧濃度、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基組成及連續(xù)培養(yǎng)時(shí)的稀釋率等都會影響質(zhì)粒穩(wěn)定性，需要進(jìn)行優(yōu)化。一般而言，適當(dāng)降低菌體的生長速率，將有利于提高重組細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒的拷貝數(shù)，防止在細(xì)胞分裂時(shí)產(chǎn)生不含質(zhì)粒細(xì)胞。

質(zhì)粒還會形成多倍體。在細(xì)胞分裂時(shí)，多倍體在子細(xì)胞中的分配只相當(dāng)于一個(gè)單倍體。因此多倍體或高聚多倍體的比例越高，不含質(zhì)粒細(xì)胞出現(xiàn)的概率也就越高。

其他造成宿主細(xì)胞丟失外源質(zhì)粒的因素還有很多。大量合成的外源蛋白質(zhì)會對宿主細(xì)胞的生長產(chǎn)生危害，含質(zhì)粒細(xì)胞的生長速度總是要比不含質(zhì)粒細(xì)胞的生長速度低，而且所含的質(zhì)粒越多，生長速度越慢；質(zhì)粒會形成多倍體，形成二倍體、四倍體等。雖然多倍體也能夠復(fù)制，但是多倍體的形成減少了細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒的數(shù)目，提高了細(xì)胞分裂時(shí)產(chǎn)生不含質(zhì)粒子細(xì)胞的概率。另一類質(zhì)粒不穩(wěn)定性是由質(zhì)粒本身或宿主細(xì)胞的基因突變引起的。例如，由于基因突變，使有些質(zhì)粒中的抗性基因有可能整合到宿主細(xì)胞的染色體DNA，使宿主細(xì)胞也獲得了抗性，在這種情況下，即使在培養(yǎng)基中加入了抗性物質(zhì)，這類不含質(zhì)粒細(xì)胞也能生長。

宿主細(xì)胞的突變會引起目標(biāo)蛋白質(zhì)表達(dá)的下降，特另別是當(dāng)質(zhì)粒中的啟動子受到宿主細(xì)胞所產(chǎn)生的某種蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)時(shí)，突變可能引起該蛋白質(zhì)合成成能力的下降，使啟動子的啟動轉(zhuǎn)錄能力降低，目標(biāo)蛋白的合成能力也就受到了影響。例如，當(dāng)質(zhì)粒采用lac啟動子時(shí)，需要加入乳糖或其類似物IPTG誘導(dǎo)才能表達(dá)，細(xì)胞吸收乳糖或IPTG需要lac滲透酶的協(xié)助下才能通過細(xì)胞膜。如果宿主細(xì)胞發(fā)生突變使lac滲透酶失活舌，將造成誘導(dǎo)劑被拒之細(xì)胞外。這樣雖然已經(jīng)加入了誘導(dǎo)劑，也無法啟動目標(biāo)產(chǎn)物表達(dá)。