什么是質粒載體
質粒（plasmid）是一類雙鏈閉合環狀DNA分子的總稱，它們在細菌中以獨立于染色體外的方式存在，可以自我復制。一個質粒就是一個DNA分子，其大小從1kb到200kb（1kb=1000堿基對）。質粒廣泛存在于細菌中，某些藍藻、綠藻和真菌細胞中也存在質粒。從不同細胞中獲得的質粒性質存在很大的差別。
常用的細菌質粒有F因子、R因子、大腸桿菌素因子等。F質粒攜帶有幫助其自身從一個細胞轉入另一個細胞的信息，R質粒則含有抗生素抗性基因。還有一些質粒攜帶著參與或控制一些特殊代謝途徑的基因，如降解質粒。
雖然質粒的復制和遺傳獨立于染色體，但質粒的復制和轉錄仍依賴于宿主所編碼的蛋白質和酶。每個質粒都有一段DNA復制起始位點的序列，使質粒DNA能在宿主細胞中自我復制。按復制方式，質粒分為松弛型和嚴緊型質粒。松弛型質粒的復制不需要質粒編碼的功能蛋白，而完全依賴于宿主提供的半衰期較長的酶來進行，這樣，即使在沒有進行蛋白質合成時，松弛型質粒仍然能夠復制。松弛型質粒在每個細胞中可以有10～100個拷貝，又稱為高拷貝質粒。嚴緊型質粒的復制則要求同時表達一種由質粒編碼的蛋白質，在每個細胞中只有1～4個拷貝，稱為低拷貝質粒。在基因工程中一般都使用松弛型載體。
pBR322是人們研究最多、使用最廣泛的載體，具備一個好載體的所有特征。pBR322大小為4363bp，有一個復制起點、一個抗氨芐青霉素基因和一個抗四環素基因。質粒上有36個單一的限制性內切酶位點，包括Hind Ⅲ、EcoR I、BamH I、Sal I、Pst I、Pvu Ⅱ等常用酶切位點。而BamH I、Sal I和Pst I分別位于四環素和氨芐青霉素抗性基因內。應用該質粒的優點是：將外源DNA片段在BamH I、Sal I或Pst I位點插入后，可引起抗生素抗性基因失活，從而能方便地篩選出重組菌。如將一個外源DNA片段插入到BamH I位點時，四環素抗性基因（Tet）失活，因此就可以通過Ampr Tets平板篩選重組菌。
將純化的pBR322質粒用一種位于抗生素抗性基因中的限制性內切酶酶解后，產生了一個具有黏性末端單鏈的線性DNA分子，把它與用同樣的限制性內切酶酶解的目的基因混合，在ATP存在下，用T4DNA連接酶連接處理后，形成了一個重組的環型DNA分子。連接產物中可能包含一些不同連接的混合物，如質粒自身環化的分子等，為了減少這種不正確的連接產物，酶切后的線性分子需先用堿性磷酸酶處理以除去質粒末端的5'磷酸基團。T4DNA連接酶不能把兩個末端都沒有磷酸基團的線狀質粒DNA連接，就減少了自身環化的可能性。
