細(xì)胞色素C的制備及測定
【實驗?zāi)康摹?/strong>
1．學(xué)習(xí)細(xì)胞色素C的理化性質(zhì)及其生物學(xué)功能。
2．掌握制備細(xì)胞色素C的原理。
3．掌握制備細(xì)胞色素C的操作技術(shù)。
【實驗原理】
細(xì)胞色素C是呼吸鏈的一個重要組成成份。是一種含鐵卟啉基團(tuán)的蛋白質(zhì)，在線粒體呼吸鏈上位于細(xì)胞色素b和細(xì)胞色素aa3之間，細(xì)胞色素C的作用是在生物氧化過程中傳遞電子。
細(xì)胞色素C分子中含賴氨酸較高，所以等電點偏堿，為pH 10.8，分子量為12000～13000道爾頓。它易溶于水及酸性溶液，且較穩(wěn)定，不易變性，組織破碎后，用酸性水溶液即能從細(xì)胞中浸提出來。
細(xì)胞色素C分為氧化型和還原型兩種，因為還原型較穩(wěn)定并易于保存，一般都將細(xì)胞色素C制成還原型的，氧化型細(xì)胞色素C在408nm、530nm有最大吸收峰，還原型細(xì)胞色素C的最大吸收峰為415nm、520nm和550nm，這一特性可用于細(xì)胞色素C的含量測定。
由于細(xì)胞色素C在心肌組織和酵母中含量豐富，常以此為材料進(jìn)行分離制備。本實驗以豬心為材料，經(jīng)過酸溶液提取，人造沸石吸附，硫酸銨溶液洗脫，三氯醋酸沉淀等步驟制備細(xì)胞色素C，并測定其含量。
【實驗材料】
1. 實驗器材
絞肉機(jī)；電磁攪拌器；電動攪拌器；離心機(jī)；72l型分光光度計；玻璃柱(2.5×30cm)；下口瓶； 燒杯(2000、1000、500m1)；量筒；移液管；玻璃漏斗和紗布；玻璃棒；透析袋
2. 實驗 試劑
⑴ 2M H 2 SO 4 溶液；1M NH 4 OH溶液；固體硫酸銨
⑵ 25％硫酸銨溶液: 100m1蒸餾水中含25克硫酸銨，約相當(dāng)于25℃時40％的飽和度
⑶ 0.2％氯化鈉溶液：稱0.2克氯化鈉，用蒸餾水溶解并定容至100ml.
⑷ BaCl 2 試劑 ： 稱12克BaCl2 , 溶于100ml蒸餾水中
⑸ 20％三氯醋酸溶液
(6) 人造沸石(60～80目)
⑺ 聯(lián)二亞硫酸鈉(Na 2 S 2 O 4 ·2H 2 O)
【實驗操作】
1．細(xì)胞色素C的制備
⑴ 材料處理:
取新鮮或冰凍豬心，除去脂肪和韌帶，用水洗去積血，將豬心切成小塊，放入絞肉機(jī)絞碎。
⑵ 提取:
稱取絞碎豬心肌肉500克，放人2000m1燒杯中，加蒸餾水1000ml，在電動攪拌器攪拌下以2M H2S04調(diào)pH至4.0(此時溶液呈暗紫色)，在室溫下攪拌提取2小時，在提取過程，使抽提液的pH值保持在4.0左右。
在即將提取完畢，停止攪拌之前，以1M NH40H調(diào)pH至6.0，停止攪拌。用八層普通紗布壓擠過濾，收集濾液。濾渣加入750m1蒸餾水，再按上述條件提取1小時，兩次提取液合并。
⑶ 中和:
用1M NH 4 OH調(diào)上述提取液至pH 7.2(此時，等電點接近7.2的一些雜蛋白溶解度小，從溶液中沉淀下來)，靜置30～40分鐘中后過濾，所得濾液準(zhǔn)備通過人造沸石柱進(jìn)行吸附。
⑷ 吸附與洗脫:
人造沸石容易吸附細(xì)胞色素C，吸附后能被25％的硫酸銨洗脫下來，利用此特性將細(xì)胞色素C與其它雜蛋白分開。具體操作如下：
①人造沸石的預(yù)處理：稱取人造沸石11g，放入500m1燒杯中，加水?dāng)嚢瑁脙A瀉法除去12秒鐘內(nèi)不下沉的過細(xì)顆粒。
② 裝柱：選擇一個底部帶有濾膜的干凈的玻璃柱(2.5×30cm)，柱下端連接一乳膠管，用夾子夾住，柱中加入蒸餾水至2/3體積，保持柱垂直，然后將己處理好的人造沸石帶水裝填人柱，注意一次裝完，避免柱內(nèi)出現(xiàn)氣泡。
③ 上樣：柱裝好后，打開夾子放水(柱內(nèi)沸石面上應(yīng)保留一薄層水)將準(zhǔn)備好的提取液裝入下口瓶，使其通過人造沸石柱進(jìn)行吸附。柱下端流出液的速度為1.0ml/分鐘。隨著細(xì)胞色素C的被吸附，柱內(nèi)人造沸石逐漸由白色變?yōu)榧t色，流出液應(yīng)為黃色或微紅色。
④ 洗脫：吸附完畢，將紅色人造沸石從柱內(nèi)取出，放入500m1燒杯中，先用自來水，后用蒸餾水?dāng)嚢柘礈熘了澹儆?00m1 0.2％NaCl溶液分三次洗滌沸石，再用蒸餾水洗至水清，按第一次裝柱方法將人造沸石重新裝入柱內(nèi)。
用25％硫酸銨溶液洗脫，流速大約2ml/分鐘，收集含有細(xì)胞色素C的紅色洗脫液，當(dāng)洗脫液紅色開始消失時，即洗脫完畢。人造沸石可再生使用。
北京天優(yōu)福康生物科技有限公司
官網(wǎng)：http://www.jyzjsd.com/
服務(wù)熱線：400-860-6160
聯(lián)系電話/微信：13718308763
QQ:2136615612 3317607072
E-mail：Tianyoubzwz@163.com
