氧化磷酸化偶聯(lián)部位的測(cè)定
確定氧化磷酸化偶聯(lián)部位通常用兩種方法。
(一)P/0值測(cè)定 P/0值指在氧化磷酸化過(guò)程中消耗一克原子氧所消耗的無(wú)機(jī)磷的克原子數(shù)，或者說(shuō)消耗一克原子氧所生成的ATP的克分子數(shù)。P/0值實(shí)質(zhì)上指的是呼吸過(guò)程中磷酸化的效率。
測(cè)定P/0值的方法通常是在一密閉的容器中加入氧化的底物、ADP、Pi、氧飽和的緩沖液，再加入線粒體制劑時(shí)就會(huì)有氧化磷酸化進(jìn)行。反應(yīng)終了時(shí)測(cè)定O2消耗量(可用氧電極法)和Pi消耗量(或ATP生成量)就可以計(jì)算出P/0值了。在反應(yīng)系統(tǒng)中加入不同的底物，可測(cè)得各自的P/0值，結(jié)合我們所了解的呼吸鏈的傳遞順序，就可以分析出大致的偶聯(lián)部位了。
表6-3 離體線粒體的P/0比值
| 底物 | 呼吸的組成 | P/0比值 | 生成ATP數(shù) |
| （1）β-羥丁酸 | NAD+→FMN→CoQ→Cyt→O2 | 2.4-2.8 | 3 |
| （2）琥珀酸 | FAN→CoQ→Cyt→O2 | 1.7 | 2 |
| （3）抗壞血酸 | Cyt→Cytaa3→O2 | 0.88 | 1 |
| （4）細(xì)胞色素c | Cytaa3→O2 | 0.61-0.68 | 1 |
從上表可以看出P/0值為小數(shù)，由于線粒體的偶聯(lián)作用在離體條件下不能完全發(fā)揮，故可認(rèn)為實(shí)際的ATP生成數(shù)是他們所接近的正整數(shù)值。
比較表中的(1)和(2)，呼吸鏈傳遞的差異是在CoQ之間，兩者ATP的生成數(shù)相差1，所以這個(gè)ATP的生成部位一定在NAD→CoQ之間。
比較表中(2)和(3)，呼吸鏈傳遞的差異是在Cyt c之間，兩者ATP的生成數(shù)相差1，所以這個(gè)ATP的生成部位在CoQ→Cyt c之間。
比較表中(3)和(4)，生成的ATP數(shù)均為1，呼吸鏈傳遞的區(qū)別是在Cyt c→Cyt aa3，故Cytc→ aa3不存在偶聯(lián)部位，而在Cyt aa3→O2之間存在著一個(gè)偶聯(lián)部位。
(二)根據(jù)氧化還原電位計(jì)算電子傳遞釋放的能量是否能滿足ATP合成的需要
氧化還原反應(yīng)中釋放的自由能△G'O與反應(yīng)底物和產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)氧化還原電位差值(△E'O)之間存在下述關(guān)系：△G'O= nF△E'O
式中n為氧化還原反應(yīng)中電子轉(zhuǎn)移數(shù)目，F(xiàn)為法拉弟常數(shù)(23.062千卡/克分子?伏特，或96500庫(kù)侖/克分子)。
一克分子ATP水解生成ADP與Pi所釋放的能量為7.3千卡，凡氧化過(guò)程中釋放的能量大于7.3千，均有可能生成一克分子ATP，就是說(shuō)可能存在有一個(gè)偶聯(lián)部位，根據(jù)上式計(jì)算，當(dāng)n=2時(shí)，△E'O=0.1583V時(shí)可釋放7.3千卡能量，所以反應(yīng)底物與生成物的標(biāo)準(zhǔn)氧化還原電位的變化大于0.1583V的部位均可能存在著一個(gè)偶聯(lián)部位。
從圖6-11可以看出，在NAD→CoQ,Cyt b→Cyt c和Cyt aa3→O2處可能存在著偶聯(lián)部位。必須明確，這種計(jì)算的基礎(chǔ)是反應(yīng)處在熱力學(xué)平衡狀態(tài)，溫度為25℃，pH為7.0，反應(yīng)底物和產(chǎn)物的濃度均為1克分子，這種條件在體內(nèi)是不存在的。因此這一計(jì)算結(jié)果只能供參考。
圖6-11 呼吸鏈中電子對(duì)傳遞時(shí)自由能的變化
綜上所述，呼吸鏈中電子傳遞和磷酸化的偶聯(lián)部位可用圖6-12表示。
圖6-12 偶聯(lián)部位示意圖
呼吸鏈磷酸化的全過(guò)程可用下述方程式表示
NADH+H++3ADP+3Pi+1/2O2→NAD++3ATP+4H2O
FADH2+2ADP+2Pi+1/2O2→FAD+2ATP+3H2O
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