鋅指核糖核酸酶
鋅指核糖核酸酶 (ZFN) 由一個(gè) DNA 識(shí)別域和一個(gè)非特異性核酸內(nèi)切酶構(gòu)成。DNA 識(shí)別域是由一系列 Cys2-His2鋅指蛋白(zinc-fingers)串聯(lián)組成(一般 3~4 個(gè))，每個(gè)鋅指蛋白識(shí)別并結(jié)合一個(gè)特異的三聯(lián)體堿基。鋅指蛋白源自轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子家族(transcription factor family)，在真核生物中從酵母到人類廣泛存在，形成alpha-beta-beta二級(jí)結(jié)構(gòu)。其中alpha螺旋的16氨基酸殘基決定鋅指的DNA結(jié)合特異性，骨架結(jié)構(gòu)保守。對(duì)決定DNA結(jié)合特異性的氨基酸引入序列的改變可以獲得新的DNA結(jié)合特異性。
現(xiàn)已公布的從自然界篩選的和人工突變的具有高特異性的鋅指蛋白可以識(shí)別所有的GNN和ANN以及部分CNN和TNN三聯(lián)體。多個(gè)鋅指蛋白可以串聯(lián)起來形成一個(gè)鋅指蛋白組識(shí)別一段特異的堿基序列，具有很強(qiáng)的特異性和可塑性，很適合用于設(shè)計(jì)ZFNs。與鋅指蛋白組相連的非特異性核酸內(nèi)切酶來自FokI的C端的96個(gè)氨基酸殘基組成的DNA剪切域(Kim et al., 1996)。FokI是來自海床黃桿菌的一種限制性內(nèi)切酶 ，只在二聚體狀態(tài)時(shí)才有酶切活性(Kim et al., 1994)，每個(gè)FokI單體與一個(gè)鋅指蛋白組相連構(gòu)成一個(gè)ZFN，識(shí)別特定的位點(diǎn)，當(dāng)兩個(gè)識(shí)別位點(diǎn)相距恰當(dāng)?shù)木嚯x時(shí)(6~8 bp)，兩個(gè)單體ZFN相互作用產(chǎn)生酶切功能。從而達(dá)到 DNA 定點(diǎn)剪切的目的。
該技術(shù)一直以來被Sangamo生物公司所壟斷，該公司只與部分科研機(jī)構(gòu)合作。現(xiàn)在這種形勢(shì)得到了改變，一個(gè)由八個(gè)實(shí)驗(yàn)室組成的協(xié)會(huì)，在分子生物學(xué)家J. Keith Joung的帶領(lǐng)下，提出了制造ZNF的一種開源方式(Maeder et al., 2008)。該組織建立了66個(gè)“鋅指”庫，選擇性地針對(duì)不同的DNA序列。從庫中建立的“鋅指核酸酶”在測(cè)試一個(gè)植物 基因和三個(gè)人類基因時(shí)大概有1-50%的高效率，這種效率可以與Sangamo、經(jīng)典基因立法相媲美。
一種DNA靶向技術(shù),若應(yīng)用于實(shí)際的科研或醫(yī)療中,需要有高度的特異性，即要避免錯(cuò)誤的酶切(off-target)。然而事實(shí)上，DNA剪切的準(zhǔn)確性由于ZNF剪切的機(jī)制而并不像人們預(yù)期的那樣強(qiáng)：DNA的剪切需要兩個(gè)FokI切割區(qū)域的二聚化，和至少一個(gè)單元結(jié)合DNA。因?yàn)槎刍倪^程是獨(dú)立于DNA剪切的，異二聚體的形成，和兩種單元所形成的同源二聚體，同樣可以造成DNA的剪切，并且他們有著不同的識(shí)別序列。可以想象，具有較低特異性的同源二聚體形式的ZNF會(huì)切割基因組中的假回文序列。而且，在某些特定條件下，單一ZNF單元結(jié)合于DNA(識(shí)別序列只有9~12 bp)也會(huì)造成DNA的剪切。如此，兩個(gè)不同的ZNF單元總共可能產(chǎn)生七種不同識(shí)別序列的內(nèi)切酶。這些非特異性行為均可能帶來ZNF毒性。
Miller等人和Szczeoek等人(2007)分別改進(jìn)了這一技術(shù)。他們構(gòu)建了一系列偏愛異二聚體形成的FokI酶。通過審查FokI的晶體結(jié)構(gòu)，兩個(gè)小組均對(duì)介導(dǎo)酶的兩個(gè)單元結(jié)合的兩個(gè)alpha螺旋上的氨基酸做了突變，以減少同源二聚體的形成：研究人員構(gòu)建了一對(duì)不對(duì)稱的界面。雖然脫靶顯現(xiàn)明顯減少，但是仍然不可避免單個(gè)ZNF單元結(jié)合于DNA時(shí)發(fā)生的酶切，也許進(jìn)一步的發(fā)展中，人們需要徹底破壞FokI部分結(jié)合DNA的能力。
ZFNs 曾用于增強(qiáng)非洲爪蟾卵細(xì)胞、線蟲、果蠅及斑馬魚細(xì)胞的同源重組(Bibikova et al., 2001; Morton et al., 2006; Meng et al, 2008; Doyon et al., 2008)。在果蠅中ZFNs介導(dǎo)的同源重組頻率相當(dāng)可觀，有時(shí)大于1%的子代發(fā)生了同源重組介導(dǎo)的基因打靶事件(Beumer et al., 2006)。在斑馬魚中，30%-50%的個(gè)體將ZFN誘導(dǎo)的突變傳給了子代，而7%~18%的子代為突變型。通過SOLEXA測(cè)序發(fā)現(xiàn)，在形態(tài)正常的胚胎中，脫靶現(xiàn)象僅出現(xiàn)1%。在植物上，Lloyd 等(2005)在擬南芥中用ZFN誘導(dǎo)了染色體基因的定點(diǎn)突變，后代的突變率高達(dá) 20%。Voytas的研究小組證明ZFNs可以提高植物基因定點(diǎn)整合和置換頻率。他們?cè)趯?shí)驗(yàn)中設(shè)計(jì)了一個(gè)缺失了600bp的靶基因GUS:NPTII,將含有該600 bp的同源DNA片段和ZFNs瞬時(shí)表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)化煙草原生質(zhì)體，轉(zhuǎn)化細(xì)胞的10%獲得基因定點(diǎn)置換，比不用ZFNs時(shí)效率提高了104~105倍。分子檢測(cè)表明20%的重組事件是精確的，沒有伴隨堿基的缺失或插入(Wright et al.,2005)。這一結(jié)果表明利用ZFNs定點(diǎn)切割染色體DNA，可以顯著提高同源重組介導(dǎo)的基因定點(diǎn)整合效率，這為基因定點(diǎn)整合和置換提供了一個(gè)非常有潛力的工具。
ZNF技術(shù)亦具有潛在的臨床應(yīng)用前景。傳統(tǒng)的基因治療的方式主要有兩種，一種是利用病毒攜帶完整的基因序列送入人體內(nèi)或者是注入一小段正確的DNA序列來修正錯(cuò)誤或者使錯(cuò)誤的基因不表現(xiàn)，然而到目前為止，事實(shí)上科學(xué)家都無法確認(rèn)這些方法在實(shí)際應(yīng)用上是有效率及安全的。而藉由同源互換的原理使得細(xì)胞自行修正錯(cuò)誤的DNA序列是發(fā)展基因治療上最基本的原則。這一過程通過兩個(gè)獨(dú)立的步驟完成：首先在DNA中引入一個(gè)雙鏈斷裂，啟動(dòng)細(xì)胞自身的修復(fù)系統(tǒng);之后“同源重組”參考引入的相似序列作為模板修復(fù)這段基因，從而實(shí)現(xiàn)指定部位的堿基替換。
Urnov et al. (2005)針對(duì)一個(gè)IL2R基因上的突變而引起嚴(yán)重的免疫不全癥 [X-linked severe combined immune deficiency (SCID)] 來設(shè)計(jì)了四指的ZFN. SCID會(huì)使T細(xì)胞失去對(duì)抗外界入侵及感染的能力，而科學(xué)家們結(jié)合注入正確的DNA片段及ZFN的方式在培養(yǎng)皿中處理這些SCID的T細(xì)胞。利用該系統(tǒng)介導(dǎo)了人類細(xì)胞IL2R酌的高效修復(fù)。在無選擇壓力下修復(fù)效率達(dá)15%~18%，而實(shí)際在體內(nèi)，修正后的細(xì)胞比原來的突變細(xì)胞具有選擇優(yōu)勢(shì)，故這樣的修復(fù)效率已足夠用于基因治療。這樣的操作與傳統(tǒng)的逆轉(zhuǎn)錄病毒等技術(shù)相比，具有明顯的優(yōu)勢(shì)：他沒有造成人們所不希望的基因重組的風(fēng)險(xiǎn)，因?yàn)樗拚e(cuò)誤的序列，而非增加一個(gè)正確的拷貝。這給利用ZFN進(jìn)行基因修復(fù)帶來希望。
但是ZNF技術(shù)用于臨床治療還有很長(zhǎng)的路要走。例如，人們不能預(yù)期引入的ZNF蛋白是不是會(huì)引起免疫系統(tǒng)的進(jìn)攻。并且至少到目前為止，這樣的技術(shù)似乎只能用于那些可以從病人體內(nèi)抽取出來的細(xì)胞，對(duì)他們進(jìn)行體外操作，再注回病人體內(nèi)：直接體內(nèi)注入基因的效率還太低了。最后，ZNF操作在細(xì)胞內(nèi)到底精確程度如何，也必須小心評(píng)估：極少的錯(cuò)誤也可能導(dǎo)致產(chǎn)生細(xì)胞癌變等嚴(yán)重的后果。
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