沙眼衣原體診斷研究進展

關鍵詞： 沙眼衣原體 診斷

　　 摘要 沙眼衣原體感染在人群中很普遍，但臨床上并未引起重視，本文綜述了近年來診斷沙眼衣原體感染的進展，著重介紹了分子生物學技術在檢測沙眼衣原體中的應用，并提出了診斷沙眼衣原體的新的擴大的金標準。

　　沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis,CT）感染是發展中國家可預防的致盲的最重要的原因，也是西方工業化國家最常見的性病。CT可引起泌尿生殖道感染，胎兒感染CT可致新生兒結膜炎、新生兒和小嬰兒肺炎，以及其他并發癥如獲得性反應性關節炎、Retier's綜合征[1]。由于CT感染臨床表現無特異性，所以常易漏診。近年來在確診CT感染方面進展迅速，本文將其綜述如下。

　　CT的形態學檢查

　　最初診斷CT感染的實驗是吉姆薩（Giemsa）染色。這種方法在CT被分離出來前50年就開始應用，通過證實被感染細胞內CT包涵體的存在而判斷是否感染CT。但是由于其敏感性和標本收集上有困難，未能成為一種常規檢測方法。此種涂片染色的標本要求必須有大量的（數以千計）上皮細胞，而鏡檢也較費時，同時也受觀測者的主觀影響。在診斷男性尿路感染時敏感性較低，其陽性率僅為培養證實CT感染的15%。但是在診斷新生兒CT結膜炎時，Giemsa染色鏡檢被認為是簡便、易行而敏感的一種方法，50%-90%的涂片可見胞漿內包涵體及大量多形核白細胞。也可將刮片標本用甲醇固定，碘染色后鏡檢，因CT包涵體含糖原，遇碘呈棕褐色，即陽性。

　　CT的細胞培養

　　1956年我國湯非凡教授首次在世界上用雞胚卵黃囊培養CT獲得成功。10年后，組織細胞培養CT成功。從病人組織中分離CT，長期以來都被作為一種確診試驗，但是非百分之百敏感，培養失敗常由于標本多變或標本收集方法不當而引起。

　　培養細胞現多常用McCoy細胞或Hela-229細胞株[2]，BHK-21細胞也對CT易感。最初操作時使用X線照射過的McCoy細胞，現常用放線菌酮處理過的單細胞層。細胞培養過程中，起決定作用的一步是將接種物離心進入培養的單細胞層內，然后所有細胞在35℃孵育48-72小時，進行Giemsa染色、碘染色或單克隆熒光抗體染色，在光學顯微鏡下尋找CT包涵體。雖然此方法特異性高達100%。因受標本采集、保存、轉運和培養等許多因素影響，多數研究顯示敏感性僅為52%-92%[3.4]。

　　CT的抗原檢測

　　一、酶免疫測定（EIA） 此方法是將酶與單克隆抗體用交聯劑結合起來，形成酶標抗體，檢測標本中有無CT抗原。如有CT抗原，則與酶標抗體發生特異性反應，加入酶的底物，底物被酶催化生成可溶性或不溶性呈色產物，即為陽性。可用肉眼或分光光度計定性或定量，其敏感性為93%-98%，10分鐘可出報告。

　　二、直接熒光抗體試驗（DFA） 此方法是利用熒光標記的單克隆抗體檢測標本中有無CT抗原。其診斷新生兒CT結膜炎的敏感性高達95%-100%，20分鐘可出報告，但需用熒光顯微鏡觀察。Thomas等[5]用不同方法測定宮頸拭子標本中的CT，EIA可檢出稀釋至10-5～10-6的原體（elementary body,EB）；而DFA對稀釋至10-8后的EB仍可陽性，敏感性較EIA為高。

　　核酸擴增技術

　　近年來，隨著分子生物學的發展，核酸擴增技術在常規感染的診斷中很快建立。這些技術主要有擴增探針（Ampliprobe）、聚合酶鏈反應（PCR）、連接酶鏈反應（LCR）、核酸自身連續序列復制技術（NASBA）和Q-B復制酶試驗。

　　一、擴增探針法　由于非培養檢測方法不斷發展，DNA 雜交也逐漸被應用于診斷CT感染。通常這些實驗特異性較高，但并非最敏感。由于需要放射性元素標記的探針而限制了其應用隨著分子生物學發展、硫標記的DNA 探針及生物素標記的DNA 探針解決了這些問題。近年來采用DNA 探針直接檢測CT tRNA及增強化學發光探針實驗（PACE）提高了檢測的敏感性。擴增探針系統依賴于檢測標志的擴增，而不是模板DNA 本身被擴增。與預期模板互補的DNA 克隆進入M13噬菌體載體，分離單鏈DNA 在固相支持物上針對模板DNA 進行雜交，與M13噬菌體基因互補的第二個探針包裹載體序列，通過堿性磷酸酶而被檢測。Thomas等[5]認為PACE dNA探針可檢出10-5CT，不如PCR敏感（PCR可檢出10-8CT）。擴增探針法檢測尿液標本CT，其敏感性和特異性分別達到92%和99%[6，7]。

　　二、PCR PCR檢測CT快速，簡便，有高度敏感性和特異性。通過特異引物和Taq dNA聚合酶，在一定條件下將標本CT靶片段擴增，然后將擴增產物行電泳檢測，據凝膠上預計分子量DNA 擴增帶的出現判斷結果。整個過程需4～5小時。1987年，Mullis和Faloona最早應用DNA 聚合經過高溫變性，降溫退火，適溫延伸三個步驟，反復循環30～40次，可將標本中的DNA 量擴增109～1012。Φstergaard等[8]經過40個循環，可檢測10-17g的CT dNA，相當于1個拷貝的質粒，檢測敏感性和特異性分別達到100%～93%。

　　三、LCR法　1991年，Barany從生棲熱菌（Thermus aquaticus）中提取耐熱DNA 連接酶并用該酶擴增DNA 獲得成功，正式命名為LCR。LCR反應需要兩對互補的寡核苷酸探針，在模板DNA 、DNA 連接酶、DNA 聚合酶存在的前提下，通過變性、復性連接的多次循環使靶DNA 大量擴增。LCR大大地改善了擴增反應的特異性和敏感性,Stary等[9]認為LCR對各種類型的CT標本都有很高的敏感性。文獻報道用LCR檢測尿標本中CT的敏感性在95%以上，特異性有99%以上[10，11]，優于PCR及EIA。Nikkari等[12]甚至報道在由CT引起的關節炎滑液的細胞中，LCR也檢出CT dNA，而PCR不能。標本中抑制物可影響LCR的結果，而將標本凍融、稀釋可減少抑制物，提高LCR的敏感性[13]。

　　四、NASBA法是一個簡單、快速擴增核酸的方法，約2小時可將RNA擴增1010倍，它是一個持續的恒溫過程，不需要特殊的儀器。類似PCR之處是利用2個引物呈指數地擴增位于引物旁的序列，不同之處在于它需要三種酶：T7RNA聚合酶、核糖核酸酶、鳥類成髓細胞性白血病病毒逆轉錄酶，且反應處于一個恒定的溫度。這三個酶產生逆轉錄和轉錄過程，導致靶序列自身復制[14]。NASBA依靠一個逆轉錄和轉錄反應持續反復循環，由互補DNA 中介復制RNA模板，寡核苷酸鏈引導DNA 合成，并為T7RNA聚合酶編碼啟動子序列。反應中首先合成雙鏈cDNA ，該cDNA 作為T7RNA聚合酶的轉錄模板。而完成cDNA 合成有賴于核糖核酸酶消化分解作為中介物的RNA-DNA 雜交物中的RNA。足夠轉錄的cDNA 產生原始模板的反義RNA，轉錄產物轉化成為含有雙鏈啟動分子的cDNA 。這些cDNA 能產生有義RNA和反義RNA，二者都能重新進入循環。NASBA擴增的效率僅輕微受初始RNA濃度影響，擴增產物的積累量與時間呈指數相關，反應在恒溫37℃下進行，迅速，1～2小時孵育后，反應產物可擴增107倍。擴增產物達到105倍僅需15分鐘而PCR需85分鐘[15]。Morre等[16]認為NASBA在檢測尿標本CT感染和宮頸標本有同樣的敏感性，且對16S rNA最敏感，只需10-5包涵體形成單位（IFU）即可檢出，比PCR敏感10倍。

　　五、Q-β復制酶試驗 Q-β復制酶催化一條被稱為MDV-1的218個堿基的RNA模板自身復制，12分鐘內復制酶可擴增MDV-1模板106拷貝，該實驗的基礎是三明治雜交、可逆性靶捕獲和Q-β復制酶擴增。反應在恒溫下進行，4小時內完成。檢測CT核糖體RNA和核糖體DNA 。使用2種類型的探針：一是特異性捕獲探針，另一是可復制的DNA 檢測分子[17]。由于該技術基于RNA的擴增，而微生物體內含有大量RNA拷貝，故能達很高的敏感性，可用于檢測活動性感染，且Q-β復制酶試驗受標本中抑制物的影響比較小[18]。An等[19]認為Q-β復制酶可檢測5個CT eB，且不受標本中抑制物的影響。

　　自從細胞培育CT成功以來，就一直作為診斷CT感染的金標準，但即使是在有經驗的實驗室，細胞培養敏感性仍然只有75%～90%。這降低了它在檢測低流行人群中CT感染的使用價值。近年來核酸擴增方法在感染性疾病診斷中的廣泛應用，LCR具有高度敏感性和特異性，在CT的診斷方法中的地位日趨重要，故Lee[20]提出了診斷CT感染的擴大的金標準，即（1）細胞培養陽性；

（2）細胞培養陰性，但LCR陽性且DFA證實。而其他核酸擴增技術，尚需進一步研究，但是非培養方法是今后CT診斷發展的趨勢。

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