細胞裂解實驗方法總結

細胞裂解

細胞裂解是改變細胞通透性和活性的重要實驗方法。主要分為化學法和機械法，前者比較溫和，后者雖然產量高，但反應更劇烈，很有可能造成細胞中的DNA斷裂。本文主要是介紹細胞的裂解方法以及實驗過程中的方法探討。

裂解方法包括化學裂解、酶裂解和機械裂解。化學裂解和酶裂解通常是比較溫和的方法，通常會很少使DNA 斷裂。這兩種方法(包括SDS 和溶菌酶處理等)提取純化DNA中常用的方法。機械裂解可以更均一的裂解細胞，同化學裂解相比，機械處理具有更高的裂解效率和更低的選擇性。機械處理可以更劇烈和全面的裂解細胞，但也會造成DNA 的斷裂。

一、機械裂解法主要有以下兩種：

1. 熱休克(Thermal shock)，既反復凍溶法，是一種常用的機械裂解方式比，通常由冷凍和解凍兩部分組成(freezing and thawing)，。原理：由于細胞內冰粒形成和剩余細胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細胞結構破碎。冷凍通常在液氮或-20 ℃冰上進行，解凍可以在37、50、65 或100 ℃水浴中進熱休克比化學裂解溫和，但是很有效，有資料表明用熱休克和溶菌酶與SDS的方法獲得了90%的細胞裂解率。

2. 超聲波處理(Ultrasonication)既利用超聲加熱的方法，把細胞破碎。但這種處理會導致DNA 的斷裂，所以加熱不宜過劇烈，要設定好超聲時間和間隙時間，一般超聲時間不超過5秒，間隙時間最好大于超聲時間，這些都有利于保護酶的活性。bead-beating 也是常用的機械處理方式，有報道指出bead-beating 比熱休克和化學裂解的細胞裂解效果更好 雖然DNA產量較高，但通常得到的DNA片段較小。

二、 化學裂解和酶裂解法(在提核酸時聯合使用)

主要是裂解液處理法，細胞裂解液的主要目的有以下幾種：

（1）利用去污劑破壞脂質雙分子層，破裂細胞；

（2）溶解蛋白；

（3）蛋白變性使其穩定；

（4）抑制蛋白酶活性。

主要根據不同的目的，裂解液的組成有所不同，主要有提取核酸和蛋白兩中。在提取RNA或DNA時，我們主要是要充分裂解細胞，得到更多的核酸；如果我們的目的是蛋白，那要根據蛋白的位置、特性等因素考慮裂解液，在提取蛋白后，再根據實驗需要復性蛋白等。以下是細胞裂解中常用試劑和其作用：

50 mM Tris-HCl pH 7.4(緩沖體系)，150 mM NaCl(等滲體系)，1 mM PMSF (強大的蛋白酶抑制劑)，1 mM EDTA(變性劑和穩定劑)，5 μg/ml Aprotinin(蛋白酶抑制劑)，5 μg/ml Leupeptin(蛋白酶抑制劑)，1% Triton x-100(破壞細胞)，1% Sodium deoxycholate(中度變性劑和蛋白溶解劑)，0.1% SDS(強變性劑和蛋白溶解劑)。7M 尿素，2M硫脲(可以提高膜蛋白的融解)，蛋白酶K等。

細胞裂解時間把握問題：孔板里細胞用PBS洗2次后，加入細胞裂解液，然后去測總蛋白含量和酶的活力，不知道細胞要裂解到什么程度?

答：因為所用的細胞類型不一樣，所以實驗的條件也需要摸索，建議這樣來做：加入細胞裂解液后，不同時間取樣，以時間和總蛋白含量和酶的活力作曲線，這樣就可以找到裂解的最佳時間，僅供參考。

原核表達的細胞裂解問題：做原核表達，用BL21表達，之后如何裂解細胞才行呢?我的菌液只有300微升，說明書上用超聲裂解細胞，但沒給出具體做法，我們這只有大的探頭，不好做，有什么好的辦法么?要是用超聲裂解，要怎么做才行?我是超聲15 s間隔10 s座4次。裂解不好，應該怎樣改呀?!

答：請試一試IFCC推薦法：

1. 收集細胞懸液

2. 4 ℃ 低溫離心(3000 rpm，5min)

3. 棄上清，加入一定量PBS(200 ul)，輕輕吹打混勻，-20 ℃ 冷凍30 min，37 ℃ 解凍，如此反復3次，可形成細胞裂解液

三、western blot細胞裂解方法個人小結：

過些天準備做western blot，昨天就提前把細胞裂解了，提出蛋白來保存。一下是我做的方法，大家參考，可能有不正確的地方，希望大家指出來，謝謝!

1. 取一瓶細胞(100 ml的瓶子)，PBS洗2次，胰酶消化，加入10 ml 培養液，制備成細胞懸液；

2. 將細胞懸液移入10 ml離心管中，4 ℃，2500 rpm，離心5 min；

3. 棄上清，加入預冷的PBS(即4 ℃存放的PBS)于離心管中，吹打，4 ℃，2500 rpm，離心5min；棄上清，重復上述步驟一次；共洗細胞2次，充分洗掉培養液；

4. 棄上清，加入200 ul細胞裂解液(每1 ml裂解液中加入10 ulPMSF)，置于冰上，裂解40 min～1 h；裂解過程中可用槍頭吹打或間斷搖動離心管，以使蛋白充分裂解；

5. 取出離心管，于4 ℃，12000 rpm，離心5 min；

6. 將上清移入EP管中，-20 ℃保存，即可。

注：本來應該在培養瓶或培養皿中裂解，但出于某種原因，我為節約細胞裂解液，故試著在離心管中裂解，不知道這樣裂解是否充分。但我想這種方法也是可以考慮的。

四、核蛋白裂解液配方與步驟：

1. 核蛋白裂解液配方

Buffer A

10 mM HEPES

1.5 mM MgCl2

10 mM KCl

0.5 mM DTT，

0.05% NP40 (or 0.05% Igepal or Tergitol) pH 7.9

Buffer B

5 mM HEPES

1.5 mM MgCl2

0.2 mM EDTA

0.5 mM DTT

26% glycerol (v/v)， pH 7.9

2. 核蛋白裂解操作步驟

Method

1. Prepare 1 ml of buffer A with added cocktail of usual inhibitors from frozen stock and store on ice.

2. Add 500 μl of buffer a per large petri dish on ice and scrape thoroughly， leave on ice for 10 min.

3. Centrifuge at 4 °C at 3000 rpm for 10 min.

4. Remove supernatant and keep it (this will contain everything except large plasma membrane pieces，

DNA， nucleoli)， extract out 10 μl for Bradford assay.

5. On ice resuspend pellet in 374 μl of buffer B and add 26 μl of 4.6 M NaCl to give 300mM NaCl (high salt

helps lyse membranes and forces DNA into solution).

6. Homogenize with 20 full strokes in Dounce or glass homogenizer on ice.

7. Leave on ice for 30 min.

8. Centrifuge at 24，000 g for 20 min at 4 °C.

9. Aliquot supernatant， remove 10 μl for Bradford assay and store at -70 °C.

注意：

細胞裂解機制被廣泛應用于各類的生物實驗中，最突出的當屬WB。為達到最佳的實驗結果，需要注意的是所有的實驗步驟都需在四度以下進行，并且避免過多的反復凍融。而且整個實驗過程中記得戴手。

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