細(xì)胞周期的測定原理與操作步驟

一、原理

細(xì)胞周期指細(xì)胞一個世代所經(jīng)歷的時間。從一次細(xì)胞分裂結(jié)束到下一次分裂結(jié)束為一個周期。細(xì)胞周期反應(yīng)了細(xì)胞增殖速度。

單個細(xì)胞的周期測定可采用縮時攝影的方法，但它不能代表細(xì)胞群體的周期，故現(xiàn)多采用其他方法測群體周期。

測定細(xì)胞周期的方法很多，有同位素標(biāo)記法、細(xì)胞 計數(shù)法等，這里介紹一種利用BrdU滲入測定細(xì)胞周期的方法。

BrdU(5-溴脫氧尿嘧啶核苷)加入培養(yǎng)基后，可做為細(xì)胞DNA復(fù)制的原料，經(jīng)過兩個細(xì)胞周期后，細(xì)胞中兩條單鏈均含BrdU的DNA將占l/2，反映在染色體上應(yīng)表現(xiàn)為一條單體淺染。如經(jīng)歷了三個周期，則染色體中約一半為兩條單體均淺染，另一半為一深一淺。細(xì)胞 如果僅經(jīng)歷了一個周期，則兩條單體均深染。計分裂相中各期比例，就可算出細(xì)胞周期的值。

二、儀器、用品與試劑

1. 儀器、用品：同常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)

2. 試劑：BrdU(1.0 mg/ml)，甲醇、冰醋酸，Giemsa染液，秋水仙素，2×SSC液

三、操作步驟

1. 細(xì)胞生長至指數(shù)期時，向培養(yǎng)液中加入BrdU，使最終濃度為10 μg/ml。

2. 44小時加秋水仙素，使每ml中含0.1 μg。

3. 48小時后常規(guī)消化細(xì)胞至離心管中，注意培養(yǎng)上清的漂浮細(xì)胞也要收集到離心管中。

4. 常規(guī)染色體制片。

5. 染色體玻片置56 ℃水浴鍋蓋上，鋪上2×SSC 液，距紫外燈管6 cm處紫外照射30分鐘。

6. 棄去2×SSC液，流水沖洗。

7. Giemsa液染色10分鐘，流水沖洗，晾干。

8. 鏡檢100個分裂相，計第一、二、三、四細(xì)胞期分裂指數(shù)。

9. 計算：

細(xì)胞 周期(Tc)=48/{(M1+2M2+3M3+4M4)/100}(小時)

附：

（1）BrdU配制: BrdU 10 mg十雙蒸水10ml 4 ℃下避光保存。

（2）2×SSC配制: NaCl 1.75克，檸檬酸三鈉，2H2O 0.88克，加水至100 ml，4 ℃保存。

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