PEG介導(dǎo)的動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)
細(xì)胞融合(Cell fusion)或細(xì)胞雜交(cell hybridization)是指真核細(xì)胞通過(guò)介導(dǎo)和培養(yǎng)，兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞合并成一個(gè)雙核或多核細(xì)胞的過(guò)程。人工的細(xì)胞融合開(kāi)始于20世紀(jì)50年代, 60年代到70代作為一門(mén)新興的技術(shù), 發(fā)展非常快, 應(yīng)用范圍也極為廣泛, 除了同種類(lèi)細(xì)胞間可以融合, 種間遠(yuǎn)緣細(xì)胞也能融合, 細(xì)胞與組織不同, 不排斥異類(lèi)、異種細(xì)胞, 動(dòng)物細(xì)胞如此，植物細(xì)胞也是如此。基因型相同的細(xì)胞融合成的雜交細(xì)胞稱(chēng)為同核體(homokaryon)；來(lái)自不同基因型的雜交細(xì)胞則稱(chēng)為異核體(heterokaryon)。
目前, 誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法有三種：病毒(Okada, 1958)、聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)(Pontecorvo, 1975)和電激(Zimermann, 1980s)。副粘病毒科的病毒，如副流感病毒(Sendai virus)和新城雞瘟病毒，在其被膜中目前發(fā)現(xiàn)了兩種糖蛋白。
較大的一種具有粘附細(xì)胞和凝血的作用；較小的一種可介導(dǎo)病毒同宿主細(xì)胞融合, 也可誘導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞融合，稱(chēng)為融合蛋白(fusion protein)。人工利用病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合即是利用病毒的這一特性, 使用時(shí)先用紫外線(xiàn)將病毒滅活, 稀釋到一定濃度加入到細(xì)胞懸液中, 誘導(dǎo)細(xì)胞融合。但病毒介導(dǎo)細(xì)胞融合方法在使用前需要病毒的繁殖與滅活，操作繁瑣，如滅活不完全則易對(duì)實(shí)驗(yàn)人員造成傷害，因此現(xiàn)在一般不使用此方法。
后兩種方法則是利用化學(xué)和物理手段，暫時(shí)使質(zhì)膜脂類(lèi)分子 的有序排列發(fā)生改變，待去掉作用因素之后，質(zhì)膜恢復(fù)原有的有序結(jié)構(gòu)，在恢復(fù)過(guò)程中便有可誘導(dǎo)相接觸的細(xì)胞發(fā)生融合。總之，這3種方法都是在相互接觸的兩細(xì)胞進(jìn)行自我修復(fù)過(guò)程中融合的。
細(xì)胞融合不僅可用于生物學(xué)的基礎(chǔ)理論研究，而且在生產(chǎn)實(shí)踐上還有重要的應(yīng)用價(jià)值，如目前在單克隆抗體的制備, 核質(zhì)關(guān)系, 體細(xì)胞的遺傳和發(fā)育, 新品種的培養(yǎng), 免疫 作用, 疾病的治療和性狀的改良, 潛伏病毒的研究等，已取得了顯著的成績(jī)。
實(shí) 驗(yàn) 目 的
1. 通過(guò)PEG介導(dǎo)的雞血細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn), 對(duì)體細(xì)胞融合有一個(gè)清楚的概念
2. 并初步掌握利用PEG介導(dǎo)動(dòng)物細(xì)胞融合的實(shí)驗(yàn)技術(shù)
實(shí) 驗(yàn) 原 理
利用PEG介導(dǎo)的動(dòng)物細(xì)胞融合，其實(shí)驗(yàn)原理到目前為止還沒(méi)有完全定論。學(xué)者們一般認(rèn)為，PEG改變各類(lèi)細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)，使兩細(xì)胞相互接觸部位的膜脂雙層中磷脂分子發(fā)生疏散、進(jìn)而使其結(jié)構(gòu)發(fā)生重排，再加上膜脂雙層的相互親合以及彼此間表面張力的作用，引起相臨的重排質(zhì)膜在修復(fù)時(shí)相互合并在一起, 使兩細(xì)胞的胞質(zhì)溝通, 從而造成相互接觸的細(xì)胞之間發(fā)生融合。
利用PEG介導(dǎo)細(xì)胞融合, 其融合效果受以下幾種因素的影響。
1. PEG的分子量與濃度: 細(xì)胞融合效果與PEG的分子量及其濃度成正比；但PEG的分子量越大、濃度越高, 對(duì)細(xì)胞的毒性也就越大。為了兼顧二者，在實(shí)驗(yàn)時(shí)常常采用的PEG分子量一般為1000~4000，濃度一般為40~60%。
2. PEG的pH值: 經(jīng)驗(yàn)證，PEG的pH值在8.0~8.2之間融合效果最好。
3. PEG的處理時(shí)間: 處理時(shí)間越長(zhǎng)，融合效果越好, 但對(duì)細(xì)胞的毒害也就越大。故一般將處理時(shí)間限制在1分鐘之內(nèi)。本實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞融合后無(wú)需繼續(xù)培養(yǎng), 故處理時(shí)間可適當(dāng)放寬至數(shù)分鐘。
4. 融合時(shí)的溫度: 由于生物膜膜的流動(dòng)性與溫度成正比，故細(xì)胞的融合效果也與溫度成正比。因此，為了獲得更好的融合效果, 在細(xì)胞可能承受的溫度范圍內(nèi)可適當(dāng)提高處理的溫度。對(duì)于哺乳動(dòng)物的細(xì), 一般采用的溫度為38~40℃。
本實(shí)驗(yàn)所用材料為雞的血細(xì)胞，這是因?yàn)? 1. 雞血細(xì)胞具有細(xì)胞核，便于對(duì)融合細(xì)胞進(jìn)行鑒別；2. 實(shí)驗(yàn)材料便宜、易得。細(xì)胞融合與否，可通過(guò)觀(guān)察細(xì)胞內(nèi)核的數(shù)目來(lái)進(jìn)行鑒別。細(xì)胞內(nèi)只有一個(gè)核，定為未融合細(xì)胞；有二至多個(gè)核，定為融合細(xì)胞。
實(shí) 驗(yàn) 用 品
一、器材
1. 主要設(shè)備: 普通離心機(jī)、普通光學(xué)顯微鏡
2. 小型器材: 100ml量筒2個(gè), 滴管10支, 10ml刻度離心管20支, 載、蓋片各20片
二、材料 新鮮雞血
三、試劑
1. Alsever液制備
葡萄糖(Glucose)
2.05g
枸椽酸鈉
0.8g
氯化鈉(NaCl)
0.42g
重蒸水
至100ml
2. 0.85%生理鹽水液
3. GKN液
氯化鈉
8g
氯化鉀(KCl)
0.4g
Na2HPO4?2H2O
1.77g
NaH2PO4?H2O
0.69g
葡萄糖
2g
酚紅(phenolred)
0.01g
溶于1000ml重蒸水中。
4. 50% PEG液 (現(xiàn)用現(xiàn)配)
根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，稱(chēng)取適量PEG(Mr.4000)放入刻度離心管內(nèi)，在酒精燈上將其加熱熔化，待冷卻至50℃，加入等體積的已預(yù)熱至50℃的GKN液并充分混勻。
實(shí) 驗(yàn) 方 法
將Alsever液與活雞翼下雞血混成1:4懸液 （抗凝效果最佳）
↓
4度冰箱保存
↓
取上述懸液加入生理鹽水混勻
↓
1200r/min離心5分鐘
↓棄上清
上述離心速率重復(fù)離心兩次(5min, 10min)
（以達(dá)到去除細(xì)胞表面粘附物質(zhì)的目的）
↓棄上清
加入適量GKN液，配成細(xì)胞懸液
↓
取懸液以血球計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)
↓
再用GKN液將紅細(xì)胞的濃度稀釋
↓
加入 50%的PEG液混勻
↓
吸取1~2滴鏡檢并計(jì)算出融合率
實(shí) 驗(yàn) 結(jié) 果
經(jīng)PEG處理后，在顯微鏡下，可觀(guān)察到未融合的單核細(xì)胞、融合后的雙核細(xì)胞和融合后的多核細(xì)胞。
細(xì)胞的融合率指在顯微鏡的視野內(nèi)，已發(fā)生融合的細(xì)胞的核的總數(shù)與此視野內(nèi)所有細(xì)胞的細(xì)胞核總數(shù)之比。可用如下公式表示：
在實(shí)驗(yàn)中統(tǒng)計(jì)融合率時(shí), 要進(jìn)行多個(gè)視野計(jì)數(shù)，然后再加以平均，以使計(jì)算更為準(zhǔn)確。
作 業(yè)
1. 繪出你所觀(guān)察到的融合細(xì)胞的形態(tài)，并計(jì)算出細(xì)胞融合率。
2. 請(qǐng)你寫(xiě)出細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)操作中應(yīng)該注意的有關(guān)事項(xiàng)。
思 考 題
1. 細(xì)胞融合方法主要有哪幾類(lèi)？各有何優(yōu)缺點(diǎn)？
答：幾類(lèi)細(xì)胞融合方法的優(yōu)缺點(diǎn)如下：
1病毒介導(dǎo)的細(xì)胞融合：優(yōu)點(diǎn)是對(duì)細(xì)胞毒性較小，融合細(xì)胞易于存活；缺點(diǎn)為使用前需要病毒的繁殖與滅活，操作繁瑣，如滅活不完全則易對(duì)實(shí)驗(yàn)人員造成傷害，因此現(xiàn)在一般不使用此方法。
2化學(xué)介導(dǎo)的細(xì)胞融合：優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便、快速省時(shí)且融合效果好；缺點(diǎn)為PEG對(duì)細(xì)胞有毒性，處理不好則會(huì)直接影響融合細(xì)胞的存活率。
3電激法：優(yōu)點(diǎn)是對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性，且操作簡(jiǎn)單；缺點(diǎn)為它除需要電融合儀外，還要求實(shí)驗(yàn)人員接受一定的技術(shù)訓(xùn)練。
2. PEG法細(xì)胞融合的影響因素有哪些？
答：
1. PEG的分子量與濃度: 細(xì)胞融合效果與PEG的分子量及其濃度成正比；但PEG的分子量越大、濃度越高, 對(duì)細(xì)胞的毒性也就越大。為了兼顧二者，在實(shí)驗(yàn)時(shí)常常采用的PEG分子量一般為1000~4000，濃度一般為40~60%。
2. PEG的pH值: 經(jīng)驗(yàn)證，PEG的pH值在8.0~8.2之間融合效果最好。
3. PEG的處理時(shí)間: 處理時(shí)間越長(zhǎng)，融合效果越好, 但對(duì)細(xì)胞的毒害也就越大。故一般將處理時(shí)間限制在1分鐘之內(nèi)。本實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞融合后無(wú)需繼續(xù)培養(yǎng), 故處理時(shí)間可適當(dāng)放寬至數(shù)分鐘。
4. 融合時(shí)的溫度: 由于生物膜膜的流動(dòng)性與溫度成正比，故細(xì)胞的融合效果也與溫度成正比。因此，為了獲得更好的融合效果, 在細(xì)胞可能承受的溫度范圍內(nèi)可適當(dāng)提高處理的溫度。對(duì)于哺乳動(dòng)物的細(xì), 一般采用的溫度為38~40℃。
3. 本實(shí)驗(yàn)中所用的PEG融合方法能否用于植物細(xì)胞？為什么？
答：本實(shí)驗(yàn)所用PEG融合方法不能直接用于未脫壁植物細(xì)胞的融合，因?yàn)橹参锛?xì)胞具有細(xì)胞壁，PEG無(wú)法介導(dǎo)其細(xì)胞融合；但是，如果將植物細(xì)胞進(jìn)行脫壁處理后，則可使用PEG融合方法進(jìn)行融合實(shí)驗(yàn)。
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