【微生物學報】代爾夫特菌PG-8降解青霉素G的特性及分子機制

發(fā)布日期：2025-12-19 15:16:19

【微生物學報】代爾夫特菌PG-8降解青霉素G的特性及分子機制

摘要

目的篩選青霉素G (penicillin G, PENG)降解菌，并解析其分解代謝的關(guān)鍵酶，為青霉素菌渣的生物處理提供菌種和基因資源。

方法以青霉素G鉀(penicillin G potassium, PGK)為底物，通過富集培養(yǎng)篩選能夠利用其為唯一碳源生長的菌株；結(jié)合基因組和轉(zhuǎn)錄組技術(shù)鑒定分解代謝的關(guān)鍵酶并分析其進化起源；表達并純化關(guān)鍵酶，解析其酶促反應(yīng)動力學參數(shù)；通過基因敲除和回補實驗揭示關(guān)鍵基因在細菌利用PGK生長過程中的生理功能。

結(jié)果獲得的代爾夫特菌屬(Delftia sp.) PG-8能夠降解并利用PGK作為唯一碳源生長，且在pH 7.0、溫度35 ℃、底物濃度為10.00 mmol/L時表現(xiàn)出最佳的底物降解效果和細菌生長狀況。PgkA能夠催化PGK快速降解[Km=(99.19±19.45) μmol/L，kcat/Km=(1.96±0.55)×105 L/(mol·s)]，并且與已完成功能鑒定的β-內(nèi)酰胺酶相比PgkA具有獨特的進化起源。PgkB也能夠催化PGK降解，但其對底物的親和力僅為PgkA的1/5，且底物催化效率也較低。菌株P(guān)G-8-ΔpgkA和PG-8-ΔpgkB降解和利用PGK生長的能力均顯著下降，且PG-8-ΔpgkA能力下降更為明顯。雖然同時敲除pgkA和pgkB的PG-8-ΔpgkAB仍能降解一定量的底物，但無法利用PGK作為唯一碳源生長。

結(jié)論PG-8是代爾夫特菌屬中第一株能夠利用PGK作為唯一碳源生長的菌株，pgkA和pgkB在PG-8利用PGK作為唯一碳源生長過程中均具有重要的生理功能，但pgkA起主導作用。

關(guān)鍵詞青霉素G降解；代爾夫特菌；篩選鑒定；酶學分析；降解機理

青霉素的發(fā)現(xiàn)無疑是20世紀公共衛(wèi)生領(lǐng)域最偉大的成就之一。隨后，人類進入了抗生素發(fā)展和利用的黃金時期，各類抗生素在醫(yī)療、農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)和生物科學研究領(lǐng)域均作出了巨大貢獻[1]。在給人類社會帶來空前藥物繁榮的同時抗生素在環(huán)境中的持續(xù)積累也引發(fā)了耐藥細菌的產(chǎn)生和耐藥基因的傳播，給生態(tài)環(huán)境和人類健康造成了嚴重危害[2-4]。調(diào)查顯示，全球34個國家的287條主要河流均受到不同程度的抗生素污染，其中覆蓋我國58個河流流域的污染情況較為嚴重[5]。雖然抗生素耐藥性是一種由來已久且在環(huán)境中普遍存在的現(xiàn)象[6]，但環(huán)境中抗生素的持續(xù)積累會加速耐藥細菌的進化和耐藥基因的傳播，進而導致全球出現(xiàn)嚴重的抗生素抗性危機[7-8]。

在種類繁多的抗生素中β-內(nèi)酰胺類抗生素的生產(chǎn)和應(yīng)用最為廣泛，占全球抗生素市場份額的65%左右[9]。中國作為全球最大的抗生素生產(chǎn)國[10]，青霉素年產(chǎn)量約占全球總產(chǎn)量的75%，其中2020年青霉素G (penicillin G, PENG)的全球消耗量占比高達32.02%[11]。研究顯示青霉素G在全球沉積物中的最高濃度達974 μg/kg[12]，已成為嚴重的環(huán)境污染物，該抗生素也被認為是導致全球性抗生素耐藥性的重要因素之一。據(jù)估計，每生產(chǎn)1 t抗生素會產(chǎn)生約8-10 t抗生素濕菌渣[13-14]。以青霉菌發(fā)酵為例，我國青霉素年產(chǎn)量約為1.5萬t，其生產(chǎn)過程中會產(chǎn)生15萬t青霉素菌渣[15]。抗生素菌渣含有殘留抗生素及眾多有毒代謝產(chǎn)物，例如青霉素菌渣中青霉素含量高達0.90-1.10 g/kg[16]，因此青霉素菌渣的處理對抗生素生產(chǎn)企業(yè)而言是一個巨大的負擔。此外，菌渣中的殘留青霉素進入土壤和水體后不僅會通過食物鏈危害人體和其他動植物健康[17-19]，還會影響微生物群落，進而誘導耐藥菌出現(xiàn)[20-22]。

對于抗生素菌渣的處置常規(guī)的吸附、膜分離、熱化學處理技術(shù)費用極其高昂[23-26]，因此經(jīng)濟有效的無害化處置策略亟待探索。微生物具有極強的環(huán)境適應(yīng)能力，面對種類繁多的抗生素污染，細菌能通過進化出相應(yīng)的分解代謝系統(tǒng)獲得生存能力。自2008年Dantas等報道了降解PENG的純培養(yǎng)微生物(未鑒定種屬)后[27]，該抗生素降解菌被陸續(xù)分離鑒定，包括副球菌屬(Paracoccus)、沙雷氏菌屬(Serratia)、鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、螯合球菌屬(Chelatococcus)、腸桿菌屬(Enterobacter)等，而且一些降解菌分解代謝PENG的代謝途徑也有少許報道。Paracoccus sp. KDSPL-02降解PENG時首先通過β-內(nèi)酰胺環(huán)水解生成青霉噻唑酸，然后水解生成苯乙酸和類似于6-氨基青霉烷酸的中間產(chǎn)物，隨后進入下游未知代謝途徑實現(xiàn)PENG降解，但該途徑相關(guān)的基因和酶尚未鑒定[28]。Crofts等[29]研究4株土壤微生物通過共享策略降解PENG時，推測這些微生物也是通過該途徑完成PENG降解，并鑒定了水解青霉噻唑酸酰胺鍵生成苯乙酸的酰胺酶。最近，Zhang等[30]在研究Sphingobacterium sp. SQW1時利用細胞和粗酶液生物轉(zhuǎn)化PENG檢測到多個疑似的中間產(chǎn)物，推測該菌株降解PENG可能存在3條代謝途徑。SQW1菌株和粗酶液降解PENG均以β-內(nèi)酰胺酶起始降解，然后通過2條不同的下游代謝途徑實現(xiàn)PENG的完全礦化；通過中間代謝產(chǎn)物推測該菌株降解PENG還可能存在第3條途徑，即由酰基轉(zhuǎn)移酶起始PENG降解生成苯乙酸和6-氨基青霉烷酸[30]。然而，該菌株中復雜的代謝途徑網(wǎng)絡(luò)均是基于代謝產(chǎn)物的推測，缺乏直接的基因和酶學研究。

目前報道的青霉素降解菌中能夠以PENG為唯一碳源生長的純培養(yǎng)菌株較少。多數(shù)研究僅止步于降解功能的鑒定，缺乏對PENG降解關(guān)鍵酶和基因的研究。本研究從青霉素菌渣中篩選到代爾夫特菌屬中第一株能夠降解PENG并利用其為唯一碳源生長的細菌PG-8 (保藏號：CCTCC M 2024394)；進一步研究了PG-8降解PENG的特性，并對參與PENG代謝的關(guān)鍵基因進行了克隆、表達純化和酶學分析，同時驗證了關(guān)鍵基因的生理功能。本研究從分子、生化和遺傳學層面系統(tǒng)闡釋了細菌降解PENG的分子機制，在抗生素菌渣微生物處理方面具有重要的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10.00，酵母提取物5.00，NaCl 5.00，121 ℃滅菌20 min。無機鹽培養(yǎng)基(minimal medium, MM) (g/L)：K2HPO4 0.76，KH2PO4 0.19，(NH4)2SO4 1.00，MgSO4 1.00，微量元素體積分數(shù)為1.00%，按需調(diào)節(jié)不同的pH，121 ℃滅菌20 min。固體培養(yǎng)基是在液體培養(yǎng)基中加入瓊脂粉，其質(zhì)量體積比為1.50%。

1.2 引物、質(zhì)粒、菌株與培養(yǎng)條件

本研究所用引物見表1，菌株和質(zhì)粒見表2。Delftia sp. PG-8及其突變株在LB或添加不同濃度青霉素G鉀(penicillin G potassium, PGK)的MM中培養(yǎng)。大腸桿菌在LB培養(yǎng)基中于37 ℃培養(yǎng)。抗生素添加終濃度：卡那霉素為50.00 μg/mL，氨芐青霉素為100.00 μg/mL，氯霉素為34.00 μg/mL，四環(huán)素為20.00 μg/mL。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

表2 本研究所用菌株和質(zhì)粒Table 2 Bacterial strains and plasmids used in this study

1.3 菌株的篩選和鑒定

取1.00 g青霉素菌渣放入裝有100.00 mL MM的錐形瓶中，加入5.00 mmol/L PGK后，于150 r/min搖床中培養(yǎng)5 d。取1 mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到新的培養(yǎng)基中，重復此操作3次。取培養(yǎng)液按10倍梯度稀釋，并均勻涂布在以PGK (5.00 mmol/L)為唯一碳源的MM平板上，30 ℃培養(yǎng)3 d，挑取單菌落進一步劃線純化。獲得的純培養(yǎng)細菌分別進行革蘭氏染色、掃描電鏡觀察和16S rRNA基因序列分析。

菌株P(guān)G-8在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600約為0.6，25 ℃、5 000 r/min離心5 min收集菌體，并用MM洗滌3次后懸浮，然后轉(zhuǎn)接至含有5.00 mmol/L PGK的MM中，使初始OD600約為0.1。接著在30 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)7 d，定時取樣并測定OD600和底物濃度。為優(yōu)化菌株P(guān)G-8降解PGK的最佳條件，分別分析不同pH (5.0-9.0)、溫度(20-40 ℃)、初始底物濃度(1.00-40.00 mmol/L)對菌株P(guān)G-8降解底物的影響。每組設(shè)置3組平行實驗，并以只含有PGK的樣品作為對照。

1.4 生物轉(zhuǎn)化分析

菌株P(guān)G-8在含有2.00 mmol/L葡萄糖的MM中培養(yǎng)至OD600為0.3，加入1.00 mmol/L PGK誘導3 h，以未加入底物的樣品為對照，設(shè)置3組平行實驗。離心收集菌體(8 000×g, 5 min)，用20.00 mmol/L磷酸緩沖液(pH 7.5)清洗2次后懸浮，使OD600為2.0。加入2.00 mmol/L底物后定時取樣(0.50 mL)，并加入等體積的甲醇劇烈振蕩5 min裂解細胞。然后高速離心(15 000×g, 30 min)，取上清進行HPLC分析。通過LC-MS進行中間代謝產(chǎn)物的鑒定。

1.5 基因組和轉(zhuǎn)錄組測定

提取菌株P(guān)G-8基因組DNA，并在北京諾禾致源科技股份有限公司完成基因組測序。菌株P(guān)G-8在含有2.00 mmol/L葡萄糖的MM中培養(yǎng)至OD600為0.3，加入1.00 mmol/L的PGK或葡萄糖(對照)誘導3 h后收集菌體，經(jīng)液氮速凍后進行轉(zhuǎn)錄組測序。

1.6 蛋白表達與純化

采用表1中的引物分別擴增pgkA和pgkB基因，使用In-Fusion? HD Cloning Kit [寶生物工程(大連)有限公司]將目的片段與經(jīng)過EcoR I和Xba I雙酶切的pBAD18載體進行連接，并轉(zhuǎn)化表達菌株E. coli TOP10。將表達菌株接種至含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)至OD600為0.6，加入終濃度0.10%的l-阿拉伯糖16 ℃、120 r/min誘導8 h，之后4 ℃、5 000 r/min離心10 min收集菌體，用預(yù)冷的50.00 mmol/L磷酸緩沖液(pH 7.5)清洗2次后重懸，在冰水浴中超聲破碎(破碎5 s，停7 s) 20 min。細胞裂解液在4 ℃、20 000×g離心45 min后，上清液加入含有Ni2+-NTA樹脂的層析柱，并用50.00 mmol/L磷酸緩沖液(pH 7.5)清洗色譜柱，除去未結(jié)合的蛋白和雜質(zhì)。依次用含有不同濃度咪唑(40.00、80.00、120.00、250.00 mmol/L)的磷酸緩沖液進行洗脫。樣品經(jīng)SDS-PAGE分析后，選擇目的蛋白較為單一的樣品透析過夜。透析后的蛋白用Ultra-15超濾管(截留分子量10 kDa，Merck Millipore公司)濃縮后用于酶活性分析。

1.7 酶學分析和產(chǎn)物鑒定

5.00 mL PgkA酶活性反應(yīng)體系包括50.00 mmol/L磷酸緩沖液(pH 7.5)、14.60 μg PgkA (不添加PgkA為對照)，加入0.10 mmol/L底物，在30 ℃啟動反應(yīng)。PgkA酶促反應(yīng)動力學體系：在5 mL磷酸緩沖溶液(pH 7.5)中加入5.90 μg PgkA，隨后加入不同濃度的底物(15.00-285.00 μmol/L)啟動反應(yīng)，30 s取樣1次，并立即加入等體積甲醇終止反應(yīng)，25 ℃、12 000 r/min離心10 min后通過HPLC進行檢測。

5.00 mL PgkB酶活性反應(yīng)體系包括50.00 mmol/L磷酸緩沖液(pH 7.5)、40.40 μg PgkB (不添加PgkB為對照)，加入0.50 mmol/L底物，在30 ℃啟動反應(yīng)。PgkB酶促反應(yīng)動力學體系：在5.00 mL磷酸緩沖溶液(pH 7.5)中加入40.40 μg PgkB，隨后加入底物(0.10-1.00 mmol/L)啟動反應(yīng)，每2 min取1次樣，隨后立即加入等體積的甲醇終止反應(yīng)，25 ℃、12 000 r/min離心10 min后進行HPLC分析。

1.8 高效液相色譜(high performance liquid chromatography, HPLC)和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(liquid chromatograph mass spectrometer, LC-MS)分析

HPLC分析采用的色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18 column色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)。流動相組成：流動相A為體積分數(shù)為0.10%的磷酸水溶液，流動相B為甲醇。梯度洗脫程序：0-20 min，33% B線性增加至90% B，并保持20 min；然后在 0.1 min內(nèi)重新回到33% B，持續(xù)保持4.9 min后結(jié)束。流速為1.00 mL/min，柱溫保持在30 ℃，進樣量為10.00 μL，檢測波長為215 nm。

LC-MS分析采用Waters BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm, 1.7 μm)進行分析，柱溫維持在30 ℃。流動相由體積分數(shù)為0.10%的磷酸水溶液(A相)和甲醇(B相)組成，流速1.00 mL/min。采用梯度洗脫程序：0-20 min內(nèi)A相從67%線性降至10%，20-25 min恢復至67% A相。進樣體積為10.00 μL。樣品經(jīng)UPLC流出后，在正離子模式下通過電噴霧電離(ESI)進入質(zhì)譜儀。ESI-MS條件設(shè)置：毛細管電壓3.00 kV，源溫度150 ℃，脫溶劑氣溫度400 ℃，氮氣(純度99.90%)作為脫溶劑氣，流速800 L/h。

1.9 pgkA和pgkB的基因敲除和回補

基因敲除實驗采用In-Fusion? HD Cloning Kit將目的基因的上游和下游約1 kb的片段以及氯霉素抗性基因連接到EcoR I和Hind III酶切的pEX18Tc上，轉(zhuǎn)化E. coli DH5α，得到敲除質(zhì)粒(表2)。將敲除載體轉(zhuǎn)化至2,6-二氨基庚二酸(2,6-DAP)營養(yǎng)缺陷型的E. coli WM3064中。含有敲除質(zhì)粒的WM3064在含有0.30 mmol/L 2,6-DAP的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600為0.6，然后與PG-8菌株接合，在含2,6-DAP的LB培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)過夜。用LB清洗混合菌體2次，稀釋涂布至含34.00 μg/mL氯霉素和質(zhì)量體積比為10%的蔗糖的LB培養(yǎng)基平板上，挑取具有抗性的菌落，并利用PCR和測序鑒定突變株。

基因互補采用廣宿主質(zhì)粒pRK415實現(xiàn)。將pgkA和pgkB基因分別連接到EcoR I和Xba I酶切的pRK415上構(gòu)建互補質(zhì)粒(表2)，電轉(zhuǎn)化至PG-8突變株中，利用測序方法鑒定陽性克隆。

1.10 菌株和基因序列編號

菌株P(guān)G-8保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，編號為CCTCC M 2024394。菌株P(guān)G-8的16S rRNA基因、pgkA、pgkB序列已在NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中存儲，序列號分別為PP077309、PV522064和PV522065。

2 結(jié)果與分析

2.1 Delftiasp. PG-8的篩選和鑒定

通過富集培養(yǎng)，從青霉素菌渣中篩選出一株能降解PGK的菌株。革蘭氏染色顯示該菌株為革蘭氏陰性細菌，掃描電子顯微鏡觀察其形態(tài)為桿狀(圖1A)。基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明，該細菌屬于代爾夫特菌(Delftia) (圖1B)，將其命名為PG-8，并保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(編號為CCTCC M 2024394)。將菌株P(guān)G-8接種于以PGK為唯一碳源的無機鹽培養(yǎng)基中，底物被快速降解；生物量(OD600)在接種后的12 h內(nèi)下降明顯，推測這是由于底物及其代謝產(chǎn)物對細菌具有毒性效應(yīng)。然而，隨著底物的進一步降解和培養(yǎng)時間的延長，細菌生物量明顯增加，這充分說明PG-8能利用PGK作為唯一碳源進行生長(圖1C)。本研究發(fā)現(xiàn)，PG-8是代爾夫特菌屬細菌中第一株能夠降解PGK并利用其為唯一碳源生長的細菌。

圖1 菌株P(guān)G-8的篩選和鑒定。A：菌株P(guān)G-8的掃描電鏡；B：菌株P(guān)G-8基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹[括號中的序號為細菌的基因組序列號，分支點上的數(shù)字為支持值，代表該分支的可信程度(值越高，可信程度越高)，標尺表示遺傳距離]；C：菌株P(guān)G-8利用PGK為唯一碳源生長。Figure 1 Screening and identification of strain PG-8. A: Scanning electron microscope image of strain PG-8; B: Phylogenetic tree of strain PG-8 based on 16S rRNA gene sequence [The serial numbers in parentheses are the genomic serial numbers of the bacteria; The numbers on the branch points are support values representing the credibility of the branch (the higher the value, the higher the credibility), and the scale indicates the genetic distance]; C: Growth of strain PG-8 using penicillin G as the sole carbon source.

2.2 PG-8對PGK的降解特性研究

考慮到PG-8是代爾夫特菌屬中第一株能夠降解PGK并利用其為唯一碳源生長的細菌，且該屬細菌降解PGK的現(xiàn)有數(shù)據(jù)較少。因此，本研究進一步分析了不同pH、溫度、底物濃度對菌株P(guān)G-8降解PGK的影響，并優(yōu)化了底物降解和細菌生長的最適條件，為后續(xù)生物修復提供數(shù)據(jù)支撐。

2.2.1 不同pH對底物降解和細菌生長的影響

當無機鹽培養(yǎng)基的pH在5.0-9.0范圍時菌株P(guān)G-8均能快速降解PGK，但pH在7.0、8.0、9.0時的降解速率明顯高于pH 5.0和6.0時的降解速率(圖2A)。當pH為8.0時菌株P(guān)G-8降解PGK的速率最快，12 h內(nèi)能完全降解初始濃度為5.00 mmol/L的PGK。當pH為5.0時底物自發(fā)降解比較明顯，說明PGK在酸性環(huán)境中不穩(wěn)定，會發(fā)生自發(fā)水解。與底物降解不同，菌株P(guān)G-8在pH 5.0和6.0條件下的生長情況優(yōu)于pH 7.0、8.0、9.0條件下的生長情況(圖2B)，該現(xiàn)象與Zhang等[30]的研究結(jié)果相似，推測可能是酸性條件下PGK的自發(fā)降解會減弱抗生素對細菌的毒性，從而有利于細菌生長。因此，綜合考慮細菌生長情況和底物自降解干擾，后續(xù)在pH 7.0進行底物降解和細菌生長研究。

圖2 不同pH對底物降解和細菌生長的影響。A：不同pH對菌株P(guān)G-8降解PGK的影響；B：不同pH對菌株P(guān)G-8生長的影響。Figure 2 Effects of different pH on substrate degradation and bacterial growth. A: Effect of different pH on the degradation of penicillin G by strain PG-8; B: Effect of different pH on the growth of strain PG-8.

2.2.2 不同溫度對菌株P(guān)G-8降解PGK的影響結(jié)果

在pH 7.0條件下設(shè)置不同溫度(20、25、30、35、40 ℃)，研究菌株P(guān)G-8在以PGK為唯一碳源生長過程中的底物降解和細菌生長情況。結(jié)果顯示，當培養(yǎng)溫度在20-35 ℃時隨著溫度升高菌株P(guān)G-8降解PGK的速率逐漸加快；當溫度進一步提升至40 ℃時降解速率減緩(圖3A)。在溫度為35 ℃時菌株P(guān)G-8在18 h內(nèi)能完全降解5.00 mmol/L的PGK。在細菌生長方面，菌株在30 ℃和35 ℃時生長狀態(tài)較好，且在35 ℃時生長速率最快(圖3B)。因此，菌株P(guān)G-8在以PGK為唯一碳源生長的最適溫度為35 ℃。

圖3 不同溫度對底物降解和細菌生長的影響。A：不同溫度對菌株P(guān)G-8降解PGK的影響；B：不同溫度對菌株P(guān)G-8生長的影響。Figure 3 Effects of different temperatures on substrate degradation and bacterial growth. A: Effect of different temperatures on the degradation of penicillin G by strain PG-8; B: Effect of different temperatures on the growth of strain PG-8.

2.2.3 不同PGK初始濃度對底物降解和細菌生長的影響

在培養(yǎng)溫度35 ℃、培養(yǎng)基pH 7.0條件下，設(shè)置不同底物濃度(1.00、5.00、10.00、20.00、40.00 mmol/L)，研究菌株P(guān)G-8在以PGK為唯一碳源生長過程中的底物降解和細菌生長情況。結(jié)果顯示，在上述條件下菌株P(guān)G-8在24 h內(nèi)能完全降解20.00 mmol/L的PGK；當?shù)孜餄舛仍黾拥?0.00 mmol/L時48 h內(nèi)能降解95.20%的底物，隨后底物濃度不再發(fā)生變化(圖4A)。細菌生長結(jié)果顯示，細菌OD600在12 h內(nèi)先下降隨后逐漸上升，而且在36 h后細菌開始快速生長(圖4B)。這些結(jié)果表明，初始底物濃度對PGK的降解和菌株P(guān)G-8的生長有顯著影響，且底物降解和細菌生長并非同步，推測菌株P(guān)G-8是利用PGK的代謝產(chǎn)物進一步作為碳源生長。

圖4 不同PGK初始濃度對底物降解和細菌生長的影響。A：不同底物濃度對菌株P(guān)G-8降解PGK的影響；B：不同底物濃度對菌株P(guān)G-8生長的影響。Figure 4 Effects of different initial concentrations of penicillin G on substrate degradation and bacterial growth. A: Effect of different substrate concentrations on the degradation of penicillin G by strain PG-8; B: Effect of different substrate concentrations on the growth of strain PG-8.

2.3 生物轉(zhuǎn)化和中間代謝產(chǎn)物的鑒定

為研究菌株P(guān)G-8中參與PGK降解的酶是否為誘導型，本研究進行了生物轉(zhuǎn)化試驗分析。結(jié)果顯示，經(jīng)過PGK誘導的PG-8 (OD600=2.0)能快速降解底物(圖5A)，隨著底物濃度的降低生物轉(zhuǎn)化速率逐漸減緩，最后2.00 mmol/L的PGK能在30 min內(nèi)被完全降解。在此期間，未經(jīng)誘導的PG-8細胞未檢測到PGK的明顯降解，表明菌株P(guān)G-8中負責起始PGK降解的酶是受底物誘導的。

圖5 PG-8生物轉(zhuǎn)化PGK及中間代謝產(chǎn)物的鑒定。A：底物誘導和非誘導菌株對PGK的降解；B：HPLC檢測中間代謝產(chǎn)物；C-F：中間代謝產(chǎn)物的質(zhì)譜圖。Figure 5 Biotransformation of PGK by strain PG-8 and the identification of intermediate metabolites. A: Degradation of PGK by induced and non-induced strains; B: HPLC detection of intermediate metabolites; C-F: Mass spectrometry analysis of intermediate metabolites.

結(jié)合HPLC和LC-MS解析菌株P(guān)G-8分解代謝PGK的中間代謝產(chǎn)物，并進行產(chǎn)物結(jié)構(gòu)鑒定。PGK被降解過程中共檢測到4個主要的中間代謝產(chǎn)物(圖5B)。根據(jù)LC-MS產(chǎn)物鑒定結(jié)果，本研究推測青霉素G首先在β-內(nèi)酰胺酶作用下生成青霉噻唑酸(產(chǎn)物1) (圖5C)，隨后脫羧生成(5,5-二甲基-2-{[(2-苯乙酰)氨基]甲基}-1,3-噻唑烯-4-羧酸) (產(chǎn)物2，去羧基青霉素噻唑酸) (圖5D)，產(chǎn)物2再通過順序脫甲基生成產(chǎn)物3 (圖5E)和產(chǎn)物4 (圖5F)，隨后進一步降解進入三羧酸循環(huán)，為菌株P(guān)G-8生長提供碳源。

2.4 參與PGK降解的基因的鑒定及進化分析

生物轉(zhuǎn)化實驗證實起始PGK分解代謝的酶是受底物誘導的，因此本研究結(jié)合基因組和轉(zhuǎn)錄組分析來探究可能負責PGK降解的基因。轉(zhuǎn)錄結(jié)果顯示，與未誘導細胞相比，PGK誘導的PG-8中編碼一個class A家族β-內(nèi)酰胺酶的基因(基因組編號為PG.8_GM002194，NCBI序列號：PV522064，命名為pgkA)上調(diào)達196.60倍。在已完成功能鑒定的細菌β-內(nèi)酰胺酶中，PgkA與皮疽諾卡氏菌(Nocardia farcinica) IFM10152的降解青霉素G的FAR-1一致性最高，為47.39%。系統(tǒng)進化分析顯示，這些功能鑒定的β-內(nèi)酰胺酶共分為3個大的分支，且PgkA獨立組成一個分支，暗示菌株P(guān)G-8中起始青霉素G分解代謝的酶可能具有其獨特的進化起源(圖6A)。緊挨pgkA的基因(基因組編號為PG.8_GM002195，NCBI序列號：PV522065，命名為pgkB)轉(zhuǎn)錄上調(diào)112.10倍。序列分析顯示，該基因編碼一個氨基酸N-乙酰轉(zhuǎn)移酶。PgkB與NCBI Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫中假茄科羅爾斯通氏菌(Ralstonia pseudosolanacearum) GMI1000的N-乙酰谷氨酸合成酶序列相似性最高，為59.00%。系統(tǒng)進化分析顯示，PgkB與該酶的進化關(guān)系最近，并且這2個酶與其他細菌屬的N-乙酰谷氨酸合成酶位于完全不同的進化分支(圖6B)，暗示它們與其他屬細菌中的酶具有不同的進化起源。

圖6 PgkA和PgkB的系統(tǒng)發(fā)育分析及菌株P(guān)G-8中的pgk基因簇。A：PgkA與其他已驗證功能的β-內(nèi)酰胺酶的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系；B：PgkB與其他屬細菌中氨基酸N-乙酰轉(zhuǎn)移酶的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系；C：pgk基因簇。Figure 6 Neighbor-joining tree showing the phylogenetic relationships of PgkA and PgkB their homologous proteins. A: Phylogenetic relationship of PgkA with other functionally validated β-lactamases; B: Phylogenetic relationship of PgkB with the amino acid N-acetyltransferases from other bacterial genera; C: Organization of the pgk gene cluster.

基因組上緊挨pgkAB的PG.8_GM002196和PG.8_GM002198分別編碼一個TolC家族的外膜孔蛋白(命名為PgkM)和一個MFS家族轉(zhuǎn)運蛋白(命名為PgkT) (圖6C)。據(jù)報道，革蘭氏陰性細菌獨特的細胞膜結(jié)構(gòu)是親水性抗生素的物理性屏障，外膜孔蛋白可以通過非特異性滲透作用使這類抗生素穿透細胞外膜，而細菌跨內(nèi)膜外泵和攝取抗生素則需要轉(zhuǎn)運蛋白來實現(xiàn)[29]。因此，本研究推測PgkM可能是負責將青霉素G從細胞外滲透進入周質(zhì)空間的外膜孔蛋白，PgkT則負責進一步跨內(nèi)膜轉(zhuǎn)運抗生素進入細胞質(zhì)，隨后由代謝酶系完成其降解。革蘭氏陰性細菌跨外膜滲透抗生素已被廣泛報道，但是利用抗生素為唯一碳源生長的細菌跨內(nèi)膜轉(zhuǎn)運底物的轉(zhuǎn)運蛋白尚未鑒定，轉(zhuǎn)運機制也尚不明確。因此，PgkT確切的轉(zhuǎn)運功能和機制還需進一步驗證。pgkA上游的PG.8_GM002193編碼一個LysR家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子PgkR，推測其可能參與了青霉素代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，其功能也有待進一步證實。此外，該菌株基因組中還包含一段完整的苯乙酸代謝基因簇(PG.8_GM006000-PG.8_GM006007)。根據(jù)青霉素G的分子結(jié)構(gòu)和文獻報道，推測這段基因簇可能也參與了PGK的下游代謝。基因組進一步分析顯示，pgkAB上下游無疑似的可轉(zhuǎn)移元件，推測這2個基因在細菌間發(fā)生基因轉(zhuǎn)移的可能性不大，這也暗示pgkAB不會因為基因轉(zhuǎn)移使環(huán)境中的其他細菌獲得耐藥性。因此推測，在利用PG-8進行青霉素G污染環(huán)境修復過程時其潛在的擴散風險較小。

2.5 PgkA和PgkB的表達純化和酶活性分析

將pgkA和pgkB基因插入到pBAD18質(zhì)粒上構(gòu)建表達載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10，并用0.1%的l-阿拉伯糖誘導進行蛋白的異源表達。SDS-PAGE分析顯示，PgkA和PgkB的分子量分別約為30.80 kDa和52.10 kDa (圖7)，與基于它們的氨基酸序列推導的分子質(zhì)量一致。通過HPLC和LC-MS分析PgkA和PgkB的活性并鑒定其催化反應(yīng)產(chǎn)物。結(jié)果顯示，PgkA能催化PGK快速降解生成青霉噻唑酸，而且酶的比活為33.90 U/mg。酶促反應(yīng)動力學結(jié)果顯示，PgkA催化PGK降解的Km=(99.19±19.45) μmol/L，kcat=(19.40±1.44) s-1，kcat/Km=(1.96±0.55)×105 L/(mol·s)，米氏常數(shù)動力學曲線如圖7A所示。對于PgkB，原本推測它可能催化PgkA的產(chǎn)物青霉噻唑酸的進一步降解。本研究發(fā)現(xiàn)，PgkB并不能催化商業(yè)化的青霉噻唑酸的降解，卻能催化PGK的有效降解生成青霉噻唑酸，催化反應(yīng)時酶的比活為6.06 U/mg。酶促反應(yīng)動力學結(jié)果顯示，PgkB催化PGK降解的Km=(533.76±90.57) μmol/L，kcat= (6.44±0.51) s-1，kcat/Km=(1.21±0.31)×104 L/(mol·s)，米氏常數(shù)動力學曲線如圖7B所示。酶學反應(yīng)結(jié)果顯示，雖然PgkA和PgkB都能催化PGK降解生成青霉噻唑酸，但是PgkA對PGK的親和力是PgkB的5.4倍，催化效率是PgkB的10倍左右，說明PgkA在PG-8降解PGK過程中起主要作用。

圖7 PgkA (A)和PgkB (B)的純化及其酶促反應(yīng)動力學分析Figure 7 Purification and enzyme kinetics analysis of PgkA (A) and PgkB (B).

2.6 基因敲除和回補驗證pgkA和pgkB在PG-8降解并利用PGK生長中的作用

為進一步驗證pgkA和pgkB的生理功能，分別構(gòu)建了pgkA和pgkB的缺失突變菌株P(guān)G-8-ΔpgkA和PG-8-ΔpgkB，以及同時敲除pgkAB的突變株P(guān)G-8-ΔpgkAB。與野生型PG-8相比，PG-8-ΔpgkA和PG-8-ΔpgkAB降解青霉素G的能力顯著下降，且無法將青霉素G完全降解，回補菌株的底物降解能力基本恢復至野生型水平。雖然PG-8-ΔpgkB仍能有效降解青霉素G，但降解速率明顯慢于野生株(圖8A)。在細菌生長方面，分別敲除pgkA和pgkB的PG-8仍能利用青霉素G為唯一碳源生長，但生長狀況明顯弱于野生型，且PG-8-ΔpgkA的生長速率比PG-8-ΔpgkB更慢，同時敲除pgkA和pgkB的雙敲除菌株P(guān)G-8-ΔpgkAB基本無法利用青霉素G生長(圖8B)。因此，結(jié)合酶學分析和基因敲除實驗證實pgkA和pgkB共同起始青霉素G的代謝，但pgkA起主導作用。

圖8 菌株P(guān)G-8及其突變株降解(A)并利用PGK為唯一碳源(B)的生長情況Figure 8 Degradation by strain PG-8 and its mutants (A) and growth using PGK as the sole carbon source (B).

3 討論

青霉素G (PENG)是一種典型的β-內(nèi)酰胺類抗生素，其在醫(yī)療、畜牧、養(yǎng)殖業(yè)等領(lǐng)域的大量使用對環(huán)境和人類健康造成了嚴重危害。自從Dantas等報道了降解PENG的純培養(yǎng)微生物(未鑒定種屬)后[27]，各種降解菌陸續(xù)被分離鑒定。目前能降解PENG的細菌有11株(表3)，但僅有少數(shù)幾株細菌能夠利用PENG為唯一碳源生長。例如，Paracoccus sp. KDSPL-02[28]、Sphingobacterium sp. SQW1[30]、霍氏腸桿菌(E. hormaechei) WM1[32]和肺炎克雷伯氏菌(K. pneumoniae) Z1[33]在利用PENG生長過程中能分別在24、12、9、24 h完全降解800.00-1 200.00、632.92、10.00、300.00 mg/L的底物。Chelatococcus sp. PC-2能在以青霉素G鈉作為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長，且在補充碳氮源的條件下對400.00 mg/L青霉素鈉的降解率達98.00%[31]。此外，目前多數(shù)報道的菌株需要補充額外碳氮源才能有效降解PENG。例如，新洋蔥伯克霍爾德氏菌(Burkholderia cenocepacia) JZ6幾乎不降解300.00 mg/L的PENG，但補充碳氮源后24 h降解率可達99.98%[35]。胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae) 3060在添加碳氮源的情況下能夠?qū)?.00 mg/L濃度的PENG徹底降解[36]。還有幾株細菌在添加額外碳源條件下能降解PENG，但無法將底物完全降解(表3)。本研究從青霉素菌渣中篩選得到的Delftia sp. PG-8能高效降解青霉素G鉀，并以其為唯一碳源進行生長，且在pH 5.0-9.0、25-40 ℃條件下能完全降解青霉素G鉀，說明該菌株具有極強的環(huán)境適應(yīng)性。此外，PG-8在高濃度底物條件下仍保持較高代謝活性。當初始青霉素G鉀濃度為20.00 mmol/L (7 450.00 mg/L)時，該菌株能完全降解底物并實現(xiàn)細菌生長；即使在底物濃度40.00 mmol/L (14 900.00 mg/L)條件下仍具有95.20%的降解效率。此外，有些代爾夫特菌屬的細菌被報道對β-內(nèi)酰胺類抗生素不具備抗藥性[40]，本研究發(fā)現(xiàn)，PG-8是代爾夫特菌屬中第一株能夠利用PENG為唯一碳源生長的菌株。

表3 不同細菌對青霉素G的降解情況Table 3 Degradation of PENG by different strains

*: Strains capable of utilizing penicillin G as the sole carbon source; -: The degradation time is unknown.

目前關(guān)于PENG的分解代謝報道了多條不同的代謝途徑。細菌β-內(nèi)酰胺酶是絕大多數(shù)抗性細菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素產(chǎn)生耐藥性的主要機制，因此青霉素噻唑酸被認為是PENG降解的主要代謝物之一[41]。菌株P(guān)aracoccus sp. KDSPL-02降解PENG時首先通過β-內(nèi)酰胺環(huán)水解生成青霉噻唑酸，然后進一步水解生成苯乙酸和類似于6-氨基青霉烷酸的中間產(chǎn)物，隨后進入下游未知代謝途徑(圖9中途徑2)[28]。Crofts等[29]研究4株土壤微生物通過共享策略降解PENG時，推測Paracoccus sp. ABC07也是通過該途徑完成PENG降解。推測Sphingobacterium sp. SQW1降解PENG時可能存在3條代謝途徑：菌株SQW1先通過β-內(nèi)酰胺酶起始PENG的降解生成青霉噻唑酸，然后通過2條不同的下游代謝途徑實現(xiàn)PENG的完全礦化(起始反應(yīng)分別類似于途徑3和4)[30]。該菌株降解PENG還可能存在第3條途徑(圖9中途徑5)，即由酰基轉(zhuǎn)移酶起始PENG降解生成苯乙酸和6-氨基青霉烷酸，這2個產(chǎn)物分別進行下游代謝完成PENG的礦化[30]。然而，菌株SQW1降解PENG的復雜代謝途徑網(wǎng)絡(luò)都只是基于可能的中間代謝產(chǎn)物的鑒定，缺乏必要的基因和酶學證據(jù)。K. pneumoniae Z1[33]代謝過程前兩步中間產(chǎn)物與PG-8相同，但第3步中間產(chǎn)物有所不同(圖9中途徑6)，而且該菌株分解代謝青霉素G的基因和酶未見報道。本研究通過中間代謝產(chǎn)物鑒定和酶學分析推測了PG-8分解代謝PENG的代謝途徑(圖9中途徑1)。PENG首先在PgkA和PgkB作用下裂解β-內(nèi)酰胺環(huán)生成青霉素噻唑酸，青霉素噻唑酸隨后脫羧轉(zhuǎn)化為去羧基青霉素噻唑酸(產(chǎn)物2)；產(chǎn)物2再經(jīng)過連續(xù)地去甲基化生成產(chǎn)物3和產(chǎn)物4。中間產(chǎn)物鑒定過程中還鑒定到了苯乙酸(phenylacetic acid, PAA)的結(jié)構(gòu)類似物1-苯基-2-丙酮，而且在PG-8的基因組中確實有完整的PAA代謝基因簇，也有研究顯示細菌在降解PENG過程中會形成PAA[29,42]。因此，推測PG-8降解PENG可能也是通過下游PAA途徑完成底物的礦化。

圖9 菌株分解代謝PENG的代謝途徑Figure 9 The metabolic pathway of PENG in the catabolism of the strain.

β-內(nèi)酰胺酶是一種廣譜的水解酶，能催化各種不同的β-內(nèi)酰胺抗生素的水解。目前報道的β-內(nèi)酰胺酶分為A-D 4類。A類、C類和D類屬于絲氨酸β-內(nèi)酰胺酶，它們的活性位點均有絲氨酸，需要利用絲氨酸進行β-內(nèi)酰胺類藥物的水解[43]。B類屬于金屬-β-內(nèi)酰胺酶，一般需要利用二價鋅離子進行藥物的水解[43]。本研究鑒定的PgkA經(jīng)過系統(tǒng)發(fā)育分析屬于A類β-內(nèi)酰胺酶，與已完成功能鑒定的β-內(nèi)酰胺酶的一致性最高為47.39%。這些A類β-內(nèi)酰胺酶的系統(tǒng)發(fā)育樹分為3個主要的分支，而PgkA獨立組成一個分支，這說明菌株P(guān)G-8中的PgkA可能具有其獨特的進化起源。通過比較酶促動力學參數(shù)，PgkA對PGK的親和力與巴西諾卡氏菌(Nocardia brasiliensis)[44]、小麥蒼白桿菌(Ochrobactrum tritici)[45]和蔗糖小浴氏菌(Kosakonia sacchari)[46]中的β-內(nèi)酰胺酶類似。PgkB雖然也能催化PGK生成青霉噻唑酸，但其底物親和力只有PgkA的1/5，催化效率相較PgkA也很低。此外，PgkB與PgkA屬于完全不同的蛋白家族，系統(tǒng)發(fā)育分析顯示PgkB屬于氨基酸N-乙酰轉(zhuǎn)移酶家族，目前尚未見該家族中的酶催化PGK降解的報道。這些都說明PgkB催化青霉素G降解的機制可能與PgkA完全不同。

分別敲除pgkA和pgkB后的PG-8突變株無論是底物降解還是細菌生長速率都比野生株明顯減弱，說明它們在體內(nèi)都參與了青霉素G的分解代謝。PG-8-ΔpgkA不能將PGK完全降解，說明pgkA在PGK降解過程中起著主導作用，這也與酶學分析結(jié)果相互驗證。將pgkAB同時敲除后的突變株P(guān)G-8-ΔpgkAB仍能降解PGK，且與PG-8-ΔpgkA的底物降解速率差不多，但PG-8-ΔpgkAB卻喪失了利用PGK為唯一碳源生長的能力。因此，本研究推測在菌株P(guān)G-8中可能還存在其他的酶能起始PENG的降解，由于酶活力不夠而達不到足夠的解毒作用，或者其催化的產(chǎn)物不能被進一步降解，所以才導致PG-8-ΔpgkAB雖然能夠降解底物，但不能利用其為唯一碳源生長。

4 結(jié)論

本研究從青霉素菌渣中獲得代爾夫特菌屬中第一株能高效降解PENG并利用其為唯一碳源生長的菌株，命名為PG-8 (CCTCC M 2024394)。該菌株在pH為7.0、溫度為35 ℃、底物濃度為10.00 mmol/L時表現(xiàn)出最佳的PGK降解和細菌生長效果。結(jié)合組學分析、中間代謝產(chǎn)物、酶學和遺傳學鑒定推測了菌株P(guān)G-8分解代謝底物的代謝途徑。PgkA能催化PGK快速降解生成青霉噻唑酸，而且系統(tǒng)發(fā)育分析暗示該酶與已完成功能鑒定的其他β-內(nèi)酰胺酶具有不同的進化起源。雖然PgkB也能催化PGK降解，但其底物親和力和催化效率顯著低于PgkA。基因敲除和回補說明pgkA和pgkB都參與了菌株起始PENG的降解，但pgkA起主要作用。本研究不僅從分子、生化和遺傳學層面系統(tǒng)闡述了細菌降解青霉素G的分子機制，也對實現(xiàn)青霉素菌渣廢棄物的修復利用具有重要意義。

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