細(xì)胞吸附試驗

一、材料和儀器

1. 海拉細(xì)胞（ATCC#CCL-2）

2. 96孔聚苯乙烯板（Fisher#07-200-91;Corning#3598）

3. MTT細(xì)胞增殖試劑盒（ATCC#30-1010K）

4. 膠原I（Sigma-Aldrich#C7661）

5. 密理博（D-MEM）高糖培養(yǎng)基DMEM（Invitrogen#10313-021）

6. 胎牛血清（ATCC#30-2020）

7. 0.5 M EDTAsolution

8. 牛血清蛋白（Invitrogen#15561-020）

9. PBS（Invitrogen#14190-144）

10. 37°C細(xì)胞培養(yǎng)孵育箱及5%CO2

11. 可以在吸收光570 nm 下使用96孔板測量的分光光度計。

二、步驟

1. 在含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。

2. 制備含有40 μg/ml 膠原I的PBS溶液，4°C保存；含有0.1%BSA的DMEM。

3. 將96孔板每孔加入30 μl 膠原溶液覆蓋，置于4°C。

4. 覆蓋12小時后，去除膠原溶液，在組織培養(yǎng)罩中于室溫下風(fēng)干平板。

5. 在吸附試驗前用血清去除細(xì)胞8小時，再用無血清的DMEM洗三次細(xì)胞。在DMEM中培養(yǎng)細(xì)胞。

6. DMEM中加入EDTA使終濃度為10 mM，用以分離細(xì)胞。顯微鏡下觀察細(xì)胞確保細(xì)胞完全分離，分離過程需要約10分鐘。

7. 用無EDTA的DMEM清洗細(xì)胞兩次；用含有0.1%BSA的DMEM重懸細(xì)胞，使細(xì)胞在DMEM中的濃度為2×105cells/ml。

8. 為了進(jìn)行細(xì)胞吸附試驗，在用血清覆蓋的96孔板的每孔中加入步驟7中的100 μl 細(xì)胞懸浮液。將平板置于37°C培養(yǎng)細(xì)胞20分
鐘，使細(xì)胞附著在表面。

9. 每孔加100 μl DMEM洗掉沒有附著的細(xì)胞，重復(fù)四次。

10. 注意：為保證實驗的一致性，多板操作時可用排槍緩慢加入或移除DMEM。

11. 洗后，加入含有10%FBS的DMEM，37°C孵育細(xì)胞4小時。

12. 每孔加10 μl MTT底物，30°C孵育細(xì)胞2小時。

13. MTT處理過的細(xì)胞會被裂解，用分光光度計在570 nm 檢測溶液吸光值。

14. 注意：可以考慮加入下列對照組來檢測每一步實驗：沒有用膠原I覆蓋的96孔板；沒有用DMEM洗的96孔板；沒有加細(xì)胞的96
孔板；沒有加MTT的96孔板。

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