常用細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法（一）

細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測(cè)

1 光學(xué)顯微鏡和倒置顯微鏡

(1) 未染色細(xì)胞:凋亡細(xì)胞的體積變小、變形,細(xì)胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象,細(xì)胞凋亡晚期可見(jiàn)凋亡小體.

貼壁細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落.

(2) 染色細(xì)胞:常用姬姆薩染色、瑞氏染色等.凋亡細(xì)胞的染色質(zhì)濃縮、邊緣化,核膜裂解、染色質(zhì)分割成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態(tài).

2 熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡

一般以細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變?yōu)橹笜?biāo)來(lái)評(píng)判細(xì)胞凋亡的進(jìn)展情況.

常用的DNA特異性染料有:HO 33342 (Hoechst 33342),HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI.三種種染料與DNA的結(jié)合是非嵌入式的,主要結(jié)合在DNA的A-T堿基區(qū).紫外光激發(fā)時(shí)發(fā)射明亮的藍(lán)色熒光.

Hoechst是與DNA特異結(jié)合的活性染料,儲(chǔ)存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度,使用時(shí)用PBS稀釋,終濃度為10 ug/ml.

DAPI為半通透性,用于常規(guī)固定細(xì)胞的染色.儲(chǔ)存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度,使用終濃度一般為10 ug/ml.

結(jié)果評(píng)判:細(xì)胞凋亡過(guò)程中細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變分為三期:Ⅰ期的細(xì)胞核呈波紋狀(rippled)或呈折縫樣(creased),部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài);Ⅱa期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化;Ⅱb期的細(xì)胞核裂解為碎塊,產(chǎn)生凋亡小體(圖1).

3 透射電子顯微鏡觀察

結(jié)果評(píng)判:凋亡細(xì)胞體積變小,細(xì)胞質(zhì)濃縮.凋亡Ⅰ期(pro-apoptosis nuclei)的細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)高度盤繞,出現(xiàn)許多稱為氣穴現(xiàn)象(cavitations)的空泡結(jié)構(gòu)(圖2);Ⅱa期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化;細(xì)胞凋亡的晚期,細(xì)胞核裂解為碎塊,產(chǎn)生凋亡小體.

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