穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的構(gòu)建

1. 2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的構(gòu)建

原理：

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，就是轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒DNA 整合到宿主細(xì)胞染色體上，使宿主細(xì)胞可

長期表達(dá)目的基因及蛋白。需要在瞬時轉(zhuǎn)染基礎(chǔ)上對靶細(xì)胞進(jìn)行篩選或者應(yīng)用高轉(zhuǎn)染效率的病毒，根據(jù)不同基因載體中所含有的抗性標(biāo)志選用相應(yīng)的藥物進(jìn)行細(xì)胞傳代，從而得到可穩(wěn)定表達(dá)目的基因的細(xì)胞系。

應(yīng)用：

    觀察目的基因及其表達(dá)蛋白在某種細(xì)胞中的功能（穩(wěn)定，可長期進(jìn)行研究）

一般流程：

1 ）    篩選濃度測定：以10~14 天細(xì)胞全部死亡的抗生素濃度為篩選濃度

2 ）    細(xì)胞接種：轉(zhuǎn)染實驗前天接種細(xì)胞，各種細(xì)胞的平板密度依據(jù)各種細(xì)胞的生長率和細(xì)胞形狀而定。進(jìn)行轉(zhuǎn)染當(dāng)天細(xì)胞密度應(yīng)達(dá)到60%~80% 覆蓋

3 ）    細(xì)胞轉(zhuǎn)染（病毒、脂質(zhì)體、電穿孔、FuGENE 6 ）

4 ）    利用質(zhì)粒上含有的抗性選擇進(jìn)行篩選

5 ）    鑒定篩選結(jié)果

前期需要準(zhǔn)備：

l           構(gòu)建好的外源基因載體

l           待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系（1 ×10⁶ 個細(xì)胞，可傳代，倍增時間小于48 小時）以及細(xì)胞培養(yǎng)條件的說明

l           若需要檢測靶基因的表達(dá)變化，請?zhí)峁┫鄳?yīng)抗體

結(jié)果呈現(xiàn)：

構(gòu)建好的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系及相關(guān)的外源基因表達(dá)分析