細胞活性測定方法介紹和使用探討

細胞活性測定方法有臺盼藍染色法、克隆（集落）形成法、3H放射性同位素摻入法、MTT法等。其中MTT法以 其快速簡便，不需要特殊檢測儀器、無放射性同位素、適合大批量檢測的特點而得到廣泛的應用。

但MTT法形成的Formazan為水不溶性的，需要加有機溶 劑溶解，由于在去上清操作時會有可能帶走小部分的Formazan，故有時重復性略差。為了解決這個問題，研究人員又開發了很多種水溶性的四氮唑鹽類：如 XTT、CCK-8（WST-8）等。

現就這三種四氮唑鹽類方法作一個簡單介紹：

1、MTT法

MTT： 化學名： 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍。檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的 藍紫色結晶甲 （Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細胞中的甲 ，用酶聯免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數量。在一定細胞數范圍內，MTT結晶形成的量與細胞數成正比。該方法已廣泛用于 一些生物活性因子的活性檢測、大規模的抗腫瘤藥物篩選、細胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。它的特點是靈敏度高、經濟。

缺點：由于MTT經還原所產生的甲 產物不溶于水，需被溶解后才能檢測。這不僅使工作量增加，也會對實驗結果的準確性產生影響，而且溶解甲 的有機溶劑對實驗者也有損害。

2、XTT法

XTT：化學名：2,3- bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl]
-2H-tetrazolium hydroxide，作為線粒體脫氫酶的作用底物，被活細胞還原成水溶性的橙黃色甲 產物。當XTT與電子偶合劑（例如PMS）聯合應用時，其所產生的水溶性的甲 產物的吸光度與活細胞的數量成正比。

優點：

1、使用方便，省去了洗滌細胞；

2、檢測快速；

3、靈敏度高，甚至可以測定較低細胞密度；

4、重復性優于MTT。

缺點：

XTT水溶液不穩定，需要低溫保存或現配現用。

3、CCK-8法或稱WST-8法

CCK- 8試劑中含有WST–8：化學名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽]，它在電子載 體1-甲氧基-5-甲基吩嗪 硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被細胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲 產物（Formazan）。生成的甲 物的數量與活細胞的數量成正比。用酶聯免疫檢測儀在450nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數量。該方法已被廣泛用于一些生物活性因子的活性檢 測、大規模的抗腫瘤藥物篩選、細胞增殖試驗、細胞毒性試驗以及藥敏試驗等。

優點：

1、使用方便，省去了洗滌細胞，不需要放射性同位素和有機溶劑；

2、檢測快速；

3、靈敏度高，甚至可以測定較低細胞密度；

4、重復性優于MTT；

5、對細胞毒性小；

6、為1瓶溶液，毋需預制，即開即用。

缺點:

1、與MTT相比，CCK-8和XTT的價格比較貴。

2、CCK-8試劑的顏色為淡紅色，與含酚紅的培養基顏色接近，不注意的話容易產生漏加或多加。