貼壁細(xì)胞的消化方法介紹

一、酶消化法。

1、胰酶。這是用得最多的。一般濃度在0.25-0.5%。作用時(shí)間根據(jù)細(xì)胞種類、作用溫度等因素而變化很大，從幾分鐘到幾十分鐘不等。0.25%的胰酶作用于單層貼壁的細(xì)胞，在37度條件下，一般消化1-5分鐘就足夠了。終止是用血清。主要作用于細(xì)胞間。配制時(shí)不能用含鈣、鎂的平衡液，否則影響活性。保存于-20度。

2、膠原酶。這種方法比較少，一般是用原代培養(yǎng) 時(shí)，從組織消化下細(xì)胞。這種方法作用溫和，對細(xì)胞損傷較小，但是，價(jià)格也較貴。中止同樣是用血清。

二、離子螯合劑：不破壞細(xì)胞表面分子 ，僅與CAMs螯合，因此，如果檢測細(xì)胞表面分子的話，盡量，甚至是一定不要用酶消化法。

1、EDTA 。用得也是非常多。一般濃度在0.02%左右。作用于細(xì)胞與間質(zhì)，對細(xì)胞間也有一定作用。注意，它能顯著影響pH值，而且在弱堿性條件下才易溶。因此，配制時(shí)應(yīng)調(diào)節(jié)好酸堿度。它不能被終和。因此，消化下來的細(xì)胞要洗一遍。

2、商品化的無酶消化液。個(gè)人的使用經(jīng)常覺得對細(xì)胞的損傷比較大，但是分離成單細(xì)胞懸液的能力確實(shí)比較強(qiáng)。

三、物理法。直接吹打或用細(xì)胞刮子將細(xì)胞刮下來。

四、冷凍法。此方法僅能用于細(xì)胞傳代時(shí)。無法使組織上的細(xì)胞脫落下來。本方法的原理，我想是因細(xì)胞冷凍后收縮，從而從培養(yǎng)瓶上脫落下來。優(yōu)點(diǎn)是：對細(xì)胞損傷小，不需要中止或洗細(xì)胞，方便，不需要另外配制消化液。特別適用那些貼壁不是特別緊，又特別嬌氣的細(xì)胞。不足是細(xì)胞常成小片脫落。此種方法曾用于因用其它方法傳代導(dǎo)致大量細(xì)胞死亡操作的間充質(zhì)干細(xì)胞、DC細(xì)胞的培養(yǎng)，效果非常滿意。具體過程是：1、用較多的4度的PBS洗滌一遍細(xì)胞(以6孔板為例，加1.5ml/孔)，2、再加0.5ml 4度的PBS，靜置操作臺(tái)上，很快細(xì)胞就小片脫落，3、輕輕吹打，細(xì)胞即完全脫落，4、按一定比例傳代。

細(xì)胞消化難題：

1，先用PBS把細(xì)胞洗兩遍，使瓶內(nèi)沒有血清了，減少對胰酶的中和，然后用新配的0.25%的胰酶加入3ml左右，放在37度，然后可以在細(xì)胞有些消化下來時(shí)，拿著瓶口，運(yùn)用手腕的力量輕輕震蕩瓶內(nèi)液體，這樣細(xì)胞很快就下來了，還不需要吹打，分散也均勻

2，成團(tuán)、絮狀：

消化液里加入edta可以減少細(xì)胞成團(tuán)的現(xiàn)象，血清可以終止胰酶的作用，如果是進(jìn)口血清的話也能終止edta的作用。用胰酶消化后胰酶可以倒掉，也可以不倒，直接加血清終止，如果消化液中加入了edta的話，就要將消化液倒干凈，如果細(xì)胞貼壁要求不是很嚴(yán)格的話，一般不需要進(jìn)行離心。

鼻咽癌細(xì)胞。這種細(xì)胞的貼壁能力很強(qiáng)，用0.5%胰酶(含0.1%EDTA)一般要消化12~15min。用PBS洗滌時(shí)要洗凈殘余的培養(yǎng)基，加入胰酶后在培養(yǎng)箱中消化(避免細(xì)胞室溫下受損以及在此溫度時(shí)胰酶活性最強(qiáng))至細(xì)胞收縮變圓(可顯微鏡下觀察)且有少許細(xì)胞脫落(有流下來的趨勢)，隨后立即棄去胰酶(如果脫落的細(xì)胞很多且需要大量細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，則不能棄去胰酶)，加入培養(yǎng)基仔細(xì)吹打(不能用無血清培養(yǎng)基或者PBS替代，否則細(xì)胞聚集成團(tuán)塊或絮狀)。一般我都離心一次棄去上清(去除殘留的胰酶及漂浮的死細(xì)胞或細(xì)胞碎片)。

消化過度

馬上用培養(yǎng)基中和，用吸管吹打細(xì)胞，收集全部的細(xì)胞到以無菌的離心管中800RPM 3分鐘。棄上清，用全培重懸，換新的培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)!!狀態(tài)不好的細(xì)胞在培養(yǎng)的過程中會(huì)死亡脫落，在換液的時(shí)候可以清除掉!!

貼壁細(xì)胞消化傳代時(shí)通常采用兩種方法：

一、加入胰酶等細(xì)胞脫落后，再加培養(yǎng)基中止胰酶作用，離心傳代;二、加入胰酶后，鏡下觀察待細(xì)胞始脫落時(shí)，棄胰酶，加培養(yǎng)液分瓶。但前者太麻煩，而后者有可能對細(xì)胞施加胰酶選擇，因?yàn)榭偸琴N壁不牢的細(xì)胞先脫落，對腫瘤細(xì)胞來說，這部分細(xì)胞有可能是惡性程度較高的細(xì)胞亞群。

一種簡單的消化傳代方法。加入PBS洗去血清或加入胰酶先中和血清的作用(30s)，棄之，再加入適量胰酶作用10s-40s(根據(jù)細(xì)胞消化的難易程度)，棄之，這樣依賴殘余的胰酶就可將細(xì)胞消化單細(xì)胞。

對于較難消化的細(xì)胞，可以用2%利多卡因消化5-8分鐘，然后再棄去，加培養(yǎng)基吹打也可以，對細(xì)胞的影響不大。

不用PBS也不用Hanks洗，只要把舊培養(yǎng)液吸的干凈一點(diǎn)，直接加酶消化應(yīng)該不會(huì)有什么問題。

棄培養(yǎng)液后，用0.04%的EDTA沖洗一次，再用1/4v的0.04%的EDTA室溫孵育5min，棄取大部分EDTA，加入與剩余EDTA等量的胰酶(預(yù)熱)總體積1/10v。消化到有細(xì)胞脫落。不過有人說EDTA對細(xì)胞不好，有證據(jù)嗎?

培養(yǎng)的BASMC：倒掉舊培養(yǎng)液加入少量胰酶沖一下，倒掉再加入0.125-0.25%胰酶約6-10滴或1ml(25ml bottle)消化再加入適量新培養(yǎng)基中和，并分瓶這種方法簡單、省事;效果很好并且不損失細(xì)胞!