阻斷FC受體方法

如果培養的細胞在細胞表面上有許多 FC 受體（如單核細胞，巨噬細胞），或者細胞在無血清的培養基上培養。通過用人 AB 型血清對細胞進行前處理后，會明顯地阻斷單克隆抗體的非特異性結合。注意此法并不適用于全血染色，因為在全

血染色中有高濃度的血清存在。

 Ⅰ 、反應體系

A、  抗體

1、   第一抗體：常用的或自備的抗體

a、    如果第一抗體或自備的抗體能夠進行熒光標記（如 FITC ， PE 或其他），請參考直接染色步驟

b、   如果第一抗體不能進行熒光標記，則參考間接染色步驟

2、   第二抗體：經熒光標記過的多克隆抗體

B、  緩沖體系： PBS(Ca²⁺ and Mg²⁺ free,e.g.,Cat.#9240,Irvine Scientific,Santa Ana,CA) ＋ 2% 新鮮小牛血清（或者 0.2%BSA ）＋ 0.1% 疊氮鈉

C、  HAB （ e.g.,Cat.#50009,Irvine Scientific,CA ），其他途徑購買的經熱失活的 HAB 或經 56 ℃ 失活 1 小時的 HAB 。將其分裝成小包裝并于 -20 ℃ 貯藏。

Ⅱ 、步驟

1、   將要檢測的樣品按常規的方法制成單細胞懸浮液。在最后的步驟中，用 1ml 預冷的緩沖液至少洗一次，再用預冷的緩沖液將細胞懸浮至濃度為 1 × 10⁷ cells/ml （從而 50 μ l=5 × 10⁵ cells ）

檢測細胞活力是否達到 90% 。如果細胞活力低于 90% ，必須通過 Ficoll-Hypaque 分離法去除死細胞，否則死細胞會非特異地結合到抗體上的。更適宜的方法是將死細胞通過流式細胞儀分析加以區分，以去除死細胞（具體請參考在通過流式細胞儀捕獲前在最后的重新懸浮細胞時加入 propidium iodide 或 7- 氨基 - 放線菌素 D 的方法）

2、   加入 50 μ l 的細胞懸浮液至離心管底部。 

3、   在每一管中分別加入 50 μ l 的 HAB ，并充分混勻，于室溫中靜置 1 分鐘以上。

4、   然后加入適宜數量的單克隆抗體至離心管底部，置于冰上。

注意：進行兩種或三種顏色染色時，請同時將所有的已經熒光標記的抗體同時加入。

5、   輕輕振蕩后，于 4 ℃ 下暗置 30 分鐘。

6、   用 1ml 的緩沖液洗兩次，然后置于 4 ℃ 下以備通過流式細胞儀進行捕獲。

間接染色法

1-6 、如前所述，用經稀釋的未標記的單克隆抗體對細胞樣品處理；

7、   將細胞沉淀重新懸浮于 50 μ l 的 HAB 中，混勻，于室溫中靜置 1 分鐘以上；

8、   加入 50 μ l 經熒光標記的第二抗體稀釋液；

9、   輕輕振蕩后于 4 ℃ 下暗置 20 分鐘；

10、  用 1ml 的緩沖液洗兩次，于 250g 下離心 5 分鐘；

11、  將樣品重新懸浮于 1ml 緩沖液中，于 4 ℃ 下避光保存待用。

注意：此法并不適用于 Ig 表面染色或用抗體直接對 FC 受體進行染色。