G418篩選慢病毒感染穩定細胞株

用慢病毒篩選穩定細胞株，以G418篩選方法為例，篩選出穩定整合Neomycin抗性基因的細胞系。

A 、 G418 抗生素最優濃度篩選

每種細胞對抗生素的敏感性不同，因此，準備建立穩定細胞系之前，需要確定能夠在10-14天殺死細胞的最佳濃度。

方法如下 ：

1、將細胞稀釋到1000個細胞/mL，接種到24孔板，每孔1ml。

2、接種后第二天在100ug/mL~1mg/mL的G418濃度范圍內進行篩選。3、每隔3天跟換1次培養液，保持G418濃度不變。

4、選擇出在10~14天內使細胞全部死亡的最低G418濃度來進行下一步的篩選試驗。由于每種細胞對G418的敏感性不同，一般變動在100ug/ml～1000ug/ml范圍。

B. 慢病毒感染細胞和穩定細胞系篩選

1 、 在6孔板培養皿內種植約5×10^4細胞CO2 孵箱培養24小時。

2 、 準備 3ml 培養基，加入Polybrene，終濃度為6-8 μg/ ml。將制備好的適量病毒顆粒加至上述培養基，輕吹混勻。去除舊的培養基，加入含病毒培養基。

3 、 病毒感染后 24小時，用新鮮的完全培養基替換含有病毒的培養基，繼續培養48小時。

4 、 換用含最優濃度G418 的培養基。根據細胞敏感性不同，以后每隔3-5天換用新鮮的含有G418的培養基，以替換含大量死細胞的培養基。待抗性細胞長滿以后，細胞轉入10cm 培養皿，同時，留一部分細胞在原來的60mm 平皿內，待細胞長滿后，收獲細胞，在蛋白或mRNA 水平鑒定基因過表達或敲低效率。

Polybrene 配制：用 0.9%的NaCl 溶解Polybrene 干粉（濃度為10 mg/ml），高壓滅菌，可以在4 ℃穩定存放1 年，也可凍存于-20℃。干粉可以在4 ℃ 穩定存放數年。

G418的配制： 取1g G418溶于1ml 1M的HEPES液中，加蒸餾水至10ml，過濾消毒，4度保存。