薄層層析溶劑/展開劑/顯色劑的選擇配制及注意事項

• 方法原理

(1)流動相利用毛細管力帶著樣品穿過固定相。

(2) 樣品與固定相的相互作用是指組份在移行過程中由于偶極 - (誘導) - 偶極相互作用，

氫鍵和范德華力的作用而產生不同程度的延緩、吸附、分散、離子交換和絡合等分離機理。

溶劑

使用的溶劑必須是“分析純”或“色譜純”，溶劑組成采用體積量比(如正丁醇 - 冰乙酸 - 水= 4：1：1，V/V/V)，或者絕對量(如18ml 甲苯 + 2 ml 甲醇)。

其總量應足以使TLC /HPTLC 板的浸入深度約為5mm。

展開劑要求新鮮配制，不要多次反復使用,如需分層，則按要求放置分層后取需要的一相(上層或下層)，備用。

一、溶劑選擇規則：

1、 考慮分離成分的極性、溶解度、吸附度。
2、 先加入極性較小的溶劑，若不容再加入少量極性大的溶劑
3、 一般根據相似相溶原則，需要注意，極性相差大的不混溶。
4、 混合溶劑通常使用一個高極性和低級性溶劑組成的混合溶劑。
5、 展開劑的比例要靠嘗試.一般根據文獻中報道的該類化合物用什么樣的展開劑，就首先嘗試使用該類展開劑，然后不斷嘗試比例，直到找到一個分離效果好的展開劑。

6、 一般把兩種溶劑混合時,采用高極性/低極性的體積比為1/3的混合溶劑,如果有分開的跡象,再調整比例(或者加入第三種溶劑),達到最佳效果;如果沒有分開的跡象(斑點較“拖”)，最好是換溶劑。

二、展開劑的選擇條件：

1  對的所需成分有良好的溶解性; 

2 可使成分間分開;
3 待測組分的Rf在0.2~0.8之間，定量測定在0.3～0.5之間;
4  不與待測組分或吸附劑發生化學反應; 

5 沸點適中，黏度較小;

6 展開后組分斑點圓且集中; ⑦混合溶劑最好用新鮮配制。

三、溶劑極性參數表

環已烷 :-0.2、石油醚(Ⅰ類，30~60℃)、石油醚(Ⅱ類，60~90℃)、正已烷:0.0、甲苯:2.4、二甲苯:2.5、苯:2.7、二氯甲烷:3.1、異丙醇:3.9、正丁醇:3.9、四氫呋喃:4.0、氯仿:4.1、乙醇:4.3、乙酸乙酯:4.4、甲醇:5.1、丙酮:5.1、乙腈:5.8、乙酸:6.0、水:10.2
1、一般來說，弱極性溶劑體系的基本兩相由正己烷和水組成，再根據需要加入甲醇、乙醇，乙酸乙酯來調節溶劑系統的極性，以達到好的分離效果，適合于生物堿、黃酮、萜類等的分離;
2、中等極性的溶劑體系由氯仿和水基本兩相組成，由甲醇、乙醇，乙酸乙酯等來調節，適合于蒽醌、香豆素，以及一些極性較大的木脂素和萜類的分離;

3、強極性溶劑，由正丁醇和水組成，也靠甲醇、乙醇，乙酸乙酯等來調節，適合于極性很大的生物堿類化合物的分離。

四、展開劑的選擇

物質分子 化學結構中，通常由較極性部分和非極性部分兩部分。

例如下面以苯丙烷為極性小部分，隨著極性基團部分的增加，總體的極性就增加，展開劑極性也增加了。

以下分開討論不同化合物極性情況及其對應的展開劑。

1、類極性較小的揮發性物質
冰片：石油醚(30～60℃)—醋酸乙酯(17:3)、 厚樸酚：苯-醋酸乙酯(9:1.5)、
α-香附酮：苯-醋酯乙酯-冰醋酸(92:5:5)、 丹皮酚：環己烷-醋酸乙酯(3:1)，

結論：以石油醚、正構烷和苯為體積百分數比較大的溶劑，通常起溶解和分離化合物的作用，而用醋酸乙酯為調節Rf(比移值)的溶劑。為了減少拖尾之類其他相似相溶原則以外的影響，適當加入添加劑，如有機酸或者有機堿。

2、類極性較小的不揮發性物質
β -谷甾醇：環己烷-醋酸乙酯-甲醇(6:2.5:1)或者環己烷-丙酮(5:2)、
熊果酸：甲苯-醋酸乙酯-冰醋酸(12:4:0.5)、 齊墩果酸：氯仿-甲醇(40:1)、
豬去氧膽酸：氯仿-乙醚-冰醋酸(2:2:1)、
大黃素：苯—醋酸乙酯—甲醇(15:2:0.2)或者苯—乙醇(8:1)、
丹參酮ⅡA：苯-醋酸乙酯-甲酸(40:25:4)、 穿心蓮內酯：氯仿-無水乙醇(9:1)

靛玉紅、靛藍氯仿-乙醇(9:1)或者苯-氯仿-丙酮(5:4:1)

結論：這類物質展開劑極性比極性較小的揮發性物質洗脫力強一些，因為這類物質極性小的母核大，而極性大的基團通常可以形成氫鍵，比如羧酸、羥基。

以上物質，母核分子 量減小、母核結構中不飽和健的增加(尤其是出現苯環)，極性基團的增加，都使極性增加，展開劑極性也增大。

這個范圍內的物質很多，一般展開劑大百分數的溶劑可以從環己烷—〉甲苯—〉二甲苯—〉苯—〉氯仿的順序，按照極性要求選擇。

這里注意，異丙醇、正丁醇極性指數也比較小，在這范圍的化合物很少用，因為粘性大、展開慢，造成斑點擴散;另外，羥基的氫鍵作用力也有不利。

調節Rf值的溶劑，從醋酸乙酯—〉甲醇—〉丙酮—〉乙醇。揮發性物質也有很多帶羰基、羥基的，但從它的揮發性就可以明白，分子間作用力不強，另外，母核與石油醚、正構烷和苯的結構差異小，估計更容易脫離硅膠吸附，更快進入溶劑中，而不需要通過提高展開劑的極性。

由于存在糖的多羥基結構，苷元的結構影響變小。

展開劑中使用極性大的有機溶劑(氯仿、醋酸乙酯、甲醇、正丁醇)和水。乙酸和甲酸的使用，一方面增大展開劑極性，另外也可以抑制硅膠羥基的作用，減少拖尾。

由于混溶性和硅膠耐酸能力的限制，水和酸的使用是有限度的。

3、類極性大的小分子 有機酸：
沒食子酸：氯仿-醋酸乙酯-甲酸(5:4:1)、阿魏酸、咖啡酸、菊苣酸、綠原酸、異綠原酸。

例如下面以苯丙烷為極性小部分，隨著極性基團部分的增加，總體的極性就增加，展開劑極性也增加了。

依次為肉桂酸、阿魏酸、咖啡酸、菊苣酸、綠原酸。相應展開劑分別為：正己烷—乙醚—冰醋酸(5:5:0.1)、苯-冰醋酸-甲醇(30:1:3)、氯仿-甲醇-甲酸(9:1: 0.5)、石油醚-乙酸乙酯-甲酸(3:6: 1)、醋酸丁酯-甲酸-水(7:2.5:2.5)。

結論：

這類物質多數是苯乙烯母核的，這個結構的極性本身比較大，另外有酚羥基和羧酸基團，個別有多羥基配基。皂苷的展開劑差不多，極性大。注意甲酸通常指的是濃度85%左右的，含有水。

4、類含氮有機物：
鹽酸小檗堿：苯-醋酸乙酯-甲醇-異丙醇-濃氨試液(12：6：3：3：0.6)(氨蒸氣飽和)或正丁醇-冰醋酸-水(7:1:2)、
麻黃堿：氯仿-甲醇-濃氨試液(20:5:0.5)或正丁醇-冰醋酸-水(8:2:1)
甘草酸銨：醋酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(15:1:1:2)。
結論分析：由于NH2硅醇基的作用很強，在強極性展開劑加有機酸、有機堿掃尾。對于極性化合物，使用正丁醇對斑點擴散影響較小，因為化合物和硅膠的作用強。

當被分離物質為弱極性物質，一般選用弱極性溶劑為洗脫劑;被分離物質為強極性成分，則須選用極性溶劑為洗脫劑。如果對某一極性物質用吸附性較弱的吸附劑(如以硅藻土或滑石粉代替硅膠)，則洗脫劑的極性亦須相應降低。

3.TLC 的通用顯色方法
理想的顯色希望靈敏度高，斑點顏色穩定、斑點與背景間的對比度好，斑點的大小及顏色的深度與物質的量成正比，在樣品組成并不完全已知的情況下，通用顯色方法顯得尤為重要，通用顯色方法主要有：
E/m T2K gV"p Fg4244131、紫外照射法：方便、不破壞樣品;
Pl o;E r"m?z s? d T$V4244132、碘蒸氣法：通用性強，與紫外法結合靈敏度高于該兩法單獨使用;
$b8M"}?(P [+e4244133、熒光試劑：制造熒光背景，使原來紫外下無熒光物質被鑒別，有熒光物質更明顯;小木蟲學術博客 J-M0D6{Rf;r

4、硫酸溶劑：對絕大多數有機物有效，但有破壞性。

4.薄層層析和紙色譜操作注意事項

1、點樣 點樣器點樣于薄層板上,一般為圓點，點樣基線距底邊1.0～1.5cm，樣點直徑一般不大于2mm,點間距離可視斑點擴散情況以不影響檢出為宜。若因樣品溶液太稀，可重復點樣，但應待前次點樣的溶劑揮發后方可重新點樣，以防樣點過大，造成拖尾、擴散等現象，而影響分離效果。點樣時必須注意勿損傷薄層表面

2、展開 將點好樣品的薄層板放入展開缸的展開劑中，浸入展開劑的深度為距原點5mm為宜，密封，待展開至規定距離(一般為8～15cm)，取出薄層板，晾干，待檢測。
注：展開缸如需預先用展開劑預平衡，可在缸中加入適量的展開劑，密閉，一般保持15-30分鐘。

3、顯色與檢視 供試品含有可見光下有顏色的成分可直接在日光下檢視，也可用噴霧法或浸漬法以適宜的顯色劑顯色，或加熱顯色，在日光下檢視。有熒光的物質或遇某些試劑可激發熒光的物質可在356nm紫外光燈下觀察熒光色譜。對于可見光下無色，但在紫外光下有吸收的成分可用帶有熒光劑的硅膠板(如GF254板)，在254nm紫外光燈下觀察熒光板面上的熒光猝滅物質形成的色譜。

PE(60-90)EtAc/PE=1:2 EtAc/PE/AcOH=15:5:1 EtAc/AcOH/n-Butanol/H2O=2:1:1:1

一直在用的是乙酸乙酯：環已烷，不斷調節比例，直到有滿意的Rf值，有拖尾時可能要加酸或堿，我一般乙酸和三乙胺。

我用了好幾年了，都還好。不妨一試!

鋪板

鋪板用的勻漿不宜過稠或過?。哼^稠，板容易出現拖動或停頓造成的層紋;過稀，水蒸發后，板表面較粗糙。勻漿配比一般是硅膠G:水=1：2～3，硅膠G:羧甲基纖維素鈉水溶液=1:2。研磨勻漿的時間，根據經驗來定，與空氣濕度有關，一般通過拿起研棒時勻漿下滴的情況來判斷，越稠越難下滴。勻漿的稀稠除影響板的平滑外，也影響板涂層的厚度，進一步影響上樣量。涂層薄，點樣易過載;涂層厚，顯色不那么明顯。通常，板的質量對薄層鑒別的影響不是很大，影響最大的是展開劑的配制和展開系統的飽和。

點樣

盡量用小的點樣管。如果有足夠的耐性，最好只用1微升的點樣管。這樣，點的斑點較小，展開的色譜圖分離度好，顏色分明。

樣品溶液的含水量越小越好，樣品溶液含水量大，點樣斑點擴散大。

樣品溶液的溶劑一般是無水乙醇、甲醇、氯仿、乙酸乙酯。

點好樣的薄層板用電吹風的熱風吹干或放入干燥器里晾干。

展開劑配制

選擇合適的量器把各組成溶劑移入分液漏斗，強烈振搖使混合液充分混勻，放置，如果分層，取用體積大的一層作為展開劑。

絕對不應該把各組成溶液倒入展開缸，振搖展開缸來配制展開劑。

混合不均勻和沒有分液的展開劑，會造成層析的完全失敗。

各組成溶劑的比例準確度對不同的分析任務有不同的要求，盡量達到實驗室儀器的最高精確度，比如：取1ml的溶劑，應使用1ml的單標移液管，移液管應符合計量認證要求，盡管多數時候這不是必須的。

展開系統的飽和一般使用的是雙槽的展開缸，一槽用來放展開劑，另一槽可加入氨水或硫酸。

把待展開的板放入兩槽間的平臺，斜架著，蓋上展開缸的蓋子。讓展開劑的蒸氣充滿展開缸，并使薄層板吸附蒸氣達到飽和，防止邊沿效應，飽和時間在半個小時左右。

展開時難免要打開蓋子把薄層板放入展開劑中，不過對薄層板與蒸氣的吸附平衡影響不大，當然動作應該盡量輕、快。

溫濕度的控制

溫濕度對薄層影響都很大。不凍結的前提下，通常溫度越低分離越好，較難的分離需在低溫下分離，例如人參皂苷。濕度的影響，估計主要是影響薄層板的吸附能力，導致選擇性(容量因子)的變化，濕度應根據實際情況確定。

溫度控制使用空調器或冰柜，濕度控制是通過在另一展開槽放置相應濃度的硫酸。

顯色

噴顯色劑顯色最重要是有好的霧化器。

Hexane(己烷)

Trimethylpentane(三甲基戊烷)

Cyclopentane(環戊烷)

n-heptane(庚烷)

Butyl chloride(丁基氯; 丁酰氯)

Trichloroethylene(三氯乙烯; 乙炔化三氯)

Trichlorotrifluoroethane(三氯三氟代乙烷)

i-propyl ether(丙基醚; 丙醚)

Chlorobenzene(氯苯)

o-dichlorobenzene(領二氯苯)

Ethyl ether(二乙醚; 醚)

Isobutyl alcohol(異丁醇)

Methylene chloride(二氯甲烷)

Ethylene dichloride(二氯化乙烯)

n-butanol(丁醇)

n-propanol(丙醇)

Tetrahydrofuran( 四氫呋喃)

i-propanol(丙醇)

Methyl ethyl ketone(甲基乙基酮)

Nitromethane(硝基甲烷)

Acetic acid(乙酸)

Dimethyl formamide(二甲基甲酰胺)

Ethylene glycol(乙二醇)

常用溶劑參數表

常用混合溶劑極性順序：

環己烷:乙酸乙酯(8:2) < 氯仿:丙酮(95:5) < 苯:丙酮(9:1) <苯:乙酸乙酯(8:2) < 氯仿:乙醚(9:1) < 苯:甲醇(95:5) < 苯:乙醚(6:4) < 環己烷:乙酸乙酯(1:1) < 氯仿:乙醚(8:2) < 氯仿:甲醇(99:1) < 苯:甲醇(9:1) < 氯仿:丙酮(85:15)< 苯:乙醚(4:6) < 苯: 乙酸乙酯(1:1) < 氯仿:甲醇(95:5) < 氯仿:丙酮(7:3) < 苯: 乙酸乙酯(3:7) < 苯:乙醚(1:9) < 乙醚:甲醇(99:1) < 乙酸乙酯:甲醇(99:1) < 苯:丙酮(1:1) < 氯仿:甲醇(9:1)

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