超氧化物歧化酶(SOD)的檢測方法
摘要：
SOD的催化使超氧自由基(O2-)被破壞，并針對氧毒性筑起了第一道防線。
SOD的活性及其檢測技術與許多不同領域都息息相關，如醫藥、生化、植物 生理、食品工程等。
在過去的幾十年中，人們已經發現了各種各樣的SOD檢測方法，但是，這些方法在選擇性、檢測速度、價格、簡便程度上都存在各自的缺陷。最近，我們發現水溶性四唑鹽如XTT，WST-1，WST-8適合用于O2-的檢測并且也可以被用于SOD的檢測。在這些四唑鹽中，WST-1靈敏度高，氧化態的吸光度低，水溶性好，因此，最適合用來做SOD檢測。這種用WST-1來檢測SOD的方法可以被用于鼠紅血球、心臟、肝臟等生化樣品中。
我們還發現了一種使用了WST-1的流式注射法檢測SOD的檢測系統，通過這個系統能夠進行快速的檢測（每小時可以檢測30個樣品）。
常用的幾種SOD檢測方法：
1.分光光度法
分光光度法是最為典型的檢測SOD的方法，這種方法使用了細胞色素 C(cytochrome C)或者氮藍四唑（NBT）。
用cytochrome C的還原法來檢測O2-是因為還原后的cytochrome C會生成紫色的染料。這是自SOD被發現以來最常用的方法
Cyt(FeⅢ) + O2- —> Cyt(FeⅡ) + O2
因為cytochrome C很容易被NADPH還原酶或者其他的還原劑所還原，因此必須要考慮樣品的污染因素。
而且，這種方法需要每隔1.5分鐘就要察看一下，因此不適合做大批量的實驗。
NBT法的原理是生成不溶于水的藍色甲臢染料(max: 560 nm)去和O2-反應。
這種染料不溶于水，在做長時程分析時會生成不均一的沉淀物，從而影響實驗數據的重現性。
為了得到水溶性的甲臢染料，許多改良后的方法如添加BSA 被人們所采用。
但是，添加了不必要的蛋白質會使數據分析變得十分復雜，而且NBT會被多種還原劑所還原。
NBT的這種特性被用于酮胺的檢測，酮胺可以作為糖尿病的標記物并且是Maillard反應的中間體。
NBT法的最大缺點是即使加入過量的SOD也不能獲得100%的抑制率，原因是NBT會與黃嘌呤氧化酶直接反應。
2． 化學發光法
用于O2-檢測的化學發光探針 同樣也能用于SOD的檢測，這種探針分為2種，一種是光澤精，另一種是熒光素衍生物（MCLA）。
這種化學發光反應對pH有高度的依賴性。
例如，光澤精只有在pH 9.0或者更高處會發出強烈的化學光。
因此，在生理的pH條件下用這種方法檢測SOD是不可行的。
另一方面，MCLA在生理條件下能夠發出較強的化學熒光，因此可以用于人腦的Cu,Zn-SOD活性的檢測。
但是，MCLA不適合用作SOD檢測的探針，因為它不單單和O2-反應，還會和單質氧反應。
而且MCLA與溶解氧反應后會發出化學光，轉移的金屬離子還會加速氧化反應。
3.電子自旋共振（ESR）光譜法
在室溫下，溶液中O2-的ESR信號不能直接被檢測出，但能夠通過自旋捕捉法間接獲得。
最常見的誘捕劑是5,5-dimethyl-1-pyrroline N-oxide(DMPO)。
由于O2- 誘捕DMPO會產生一個特殊的光譜圖，因此ESR法是O2-檢測的方法中特異性最好的一種。
然而，DMPO與O2-間的二階速度常數比O2-自發反應常數相對要低，因此需要向溶液中加入大量的DMPO（如：終濃度為0.45M）。
這樣，每次試驗所要用的DMPO將花去大筆的經費。
這種方法的另一個問題是在實驗中需要一套較為昂貴的ESR設備。
4．利用水溶性四唑鹽檢測SOD的新方法
為了克服上述的諸多問題，我們在做SOD檢測時需要考慮如下幾個方面：實驗設備要簡單、經濟，pH靈敏度要低，對O2-有高度的特異性。如果用分光光度計作為一種簡單的實驗設備的話，就需要一種與cytochrome C和NBT相似的比色探針。檢測中最重要的一點是在沒有其他物質干擾的情況下，測定出SOD100%的抑制率。為了得到一種新的檢測SOD的方法，我們對還原后能生成水溶性甲臢的四唑鹽作了一系列的實驗。
5．1 XTT
XTT是一種在1988年首次被報道的水溶性四唑鹽，自從那時起，它就被用作細菌或者哺乳動物細胞電子轉移系統的底物。
它的結構如圖1所示。NBT具有一個雙四唑鹽結構，而XTT的結構則為單四唑鹽并且有兩個璜酸基團。
我們用XTT來檢測SOD，如圖2所示，隨著SOD濃度的上升，可以觀察到100%的抑制率。這種100%的抑制率在過去用NBT法時從沒得到過。即使在不同的pH條件下，仍能觀察到100%的抑制率。XTT的這種100%的抑制率意味著XTT只會被O2-特異地還原，XTT解決了NBT所不能解決的問題。
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