RNA探針
RNA探針是一類很有前途的核酸探針，由于RNA是單鏈分子，所以它與靶序列的雜交反應(yīng)效率極高。早期采用的RNA探針是細(xì)胞mRNA探針和病毒RNA探針，這些RNA是在細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄或病毒復(fù)制過程中得到標(biāo)記的，標(biāo)記效率往往不高，且受到多種因素的制約。這類RNA探針主要用于研究目的，而不是用于檢測。例如，在篩選逆轉(zhuǎn)錄病毒人類免疫缺陷病毒（HIV）的基因組DNA克隆時，因無DNA探針可利用，就利用HIV的全套標(biāo)記mRNA作為探針，成功地篩選到多株HIV基因組DNA克隆。又如進(jìn)行中的轉(zhuǎn)錄分析（nuclear run on transcrip－tion assay）時，在體外將細(xì)胞核分離出來，然后在α-32P-ATP的存在下進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，所合成mR－NA均摻入同位素而得到標(biāo)記，此混合mRNA與固定于硝酸纖維素濾膜上的某一特定的基因的DNA進(jìn)行雜交，便可反映出該基因的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)，這是一種反向探針實(shí)驗(yàn)技術(shù)。
近幾年體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)不斷完善，已相繼建立了單向和雙向體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。該系統(tǒng)主要基于一類新型載體pSP和pGEM，這類載體在多克隆位點(diǎn)兩側(cè)分別帶有SP6啟動子和T7啟動子，在SP6RNA聚合酶或T7RNA聚合酶作用下可以進(jìn)行RNA轉(zhuǎn)錄，如果在多克隆位點(diǎn)接頭中插入了外源DNA片段，則可以此DNA兩條鏈中的一條為模板轉(zhuǎn)錄生成RNA。這種體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)效率很高，在1h內(nèi)可合成近10μg的RNA產(chǎn)生，只要在底物中加入適量的放射性或生物素標(biāo)記的NTP，則所合成的RNA可得到高效標(biāo)記。該方法能有效地控制探針的長度并可提高標(biāo)記物的利用率。
值得一提的是，通過改變外源基因的插入方向或選用不同的RNA聚合酶，可以控制RNA的轉(zhuǎn)錄方向，即以哪條DNA鏈以模板轉(zhuǎn)錄RNA。這種可以得到同義RNA探針（與mRNA同序列）和反義RNA探針（與mRNA互補(bǔ)），反義RNA又稱cRNA，除可用于反義核酸研究外，還可用于檢測mRNA的表達(dá)水平。在這種情況下，因?yàn)樘结樅桶行蛄芯鶠閱捂湥噪s交的效率要比DNA-DNA雜交高幾個數(shù)量級。RNA探針除可用于檢測DNA和mRNA外，還有一個重要用途，在研究基因表達(dá)時，常常需要觀察該基因的轉(zhuǎn)錄狀況。在原核表達(dá)系統(tǒng)中外源基因不僅進(jìn)行正向轉(zhuǎn)錄，有時還存在反向轉(zhuǎn)錄（即生成反義RNA），這種現(xiàn)象往往是外源基因表達(dá)不高的重要原因。另外，在真核系統(tǒng)，某些基因也存在反向轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生反義RNA，參與自身表達(dá)的調(diào)控。在這些情況下，要準(zhǔn)確測定正向和反向轉(zhuǎn)錄水平就不能用雙鏈DNA探針，而只能用RNA探針或單鏈DNA探針。
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