熒光原位雜交（FISH）技術(shù)
1974年Evans首次將染色體顯帶技術(shù)和染色體原位雜交聯(lián)合應(yīng)用，提高了定位的準(zhǔn)確性。20世紀(jì)70年代后期人們開始探討熒光標(biāo)記的原位雜交，即FISH技術(shù)。1981年Harper成功地將單拷貝的DNA序列定位到G顯帶標(biāo)本上，標(biāo)志著染色體定位技術(shù)取得了重要進(jìn)展。20世紀(jì)90年代，隨著人類基因組計(jì)劃的進(jìn)行，由于繪制高分辨人類基因組圖譜的需要，F(xiàn)ISH技術(shù)得到了迅速的發(fā)展和廣泛應(yīng)用。
1．原理
FISH(fluorescence in situ hybridization)技術(shù)是一種重要的非放射性原位雜交技術(shù)。它的基本原理是:如果被檢測的染色體或DNA纖維切片上的靶DNA與所用的核酸探針是同源互補(bǔ)的，二者經(jīng)變性-退火-復(fù)性，即可形成靶DNA與核酸探針的雜交體。將核酸探針的某一種核苷酸標(biāo)記上報告分子如生物素、地高辛，可利用該報告分子與熒光素標(biāo)記的特異親和素之間的免疫化學(xué)反應(yīng)，經(jīng)熒光檢測體系在鏡下對待測DNA進(jìn)行定性、定量或相對定位分析。
2．實(shí)驗(yàn)流程
FISH樣本的制備→探針的制備→探針標(biāo)記→雜交→染色體顯帶→熒光顯微鏡檢測→結(jié)果分析。
3．特點(diǎn)
原位雜交的探針按標(biāo)記分子類型分為放射性標(biāo)記和非放射性標(biāo)記。用同位素標(biāo)記的放射性探針優(yōu)勢在于對制備樣品的要求不高，可以通過延長曝光時間加強(qiáng)信號強(qiáng)度，故較靈敏。缺點(diǎn)是探針不穩(wěn)定、自顯影時間長、放射線的散射使得空間分辨率不高、及同位素操作較繁瑣等。采用熒光標(biāo)記系統(tǒng)則可克服這些不足，這就是FISH技術(shù)。FISH技術(shù)作為非放射性檢測體系，具有以下優(yōu)點(diǎn):
1、熒光 試劑 和探針經(jīng)濟(jì)、安全；
2、探針穩(wěn)定，一次標(biāo)記后可在兩年內(nèi)使用；
3、實(shí)驗(yàn)周期短、能迅速得到結(jié)果、特異性好、定位準(zhǔn)確；
4、FISH可定位長度在1kb的DNA序列，其靈敏度與放射性探針相當(dāng)；
5、多色FISH通過在同一個核中顯示不同的顏色可同時檢測多種序列；
6、既可以在玻片上顯示中期染色體數(shù)量或結(jié)構(gòu)的變化，也可以在懸液中顯示間期染色體DNA的結(jié)構(gòu)。
缺點(diǎn)：不能達(dá)到100%雜交，特別是在應(yīng)用較短的cDNA探針時效率明顯下降。
4．應(yīng)用
該技術(shù)不但可用于已知基因或序列的染色體定位，而且也可用于未克隆基因或遺傳標(biāo)記及染色體畸變的研究。在基因定性、定量、整合、表達(dá)等方面的研究中頗具優(yōu)勢。
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