豬腦脂質(zhì)的提取及其分離鑒定
[原理]
動物腦組織富含多種脂質(zhì)，有甘油磷脂、鞘氨醇磷脂、糖脂、膽固醇等。本實(shí)驗(yàn)采用Blign和Dyer方法，提取豬腦脂質(zhì)，快速有效。首先使用一相醇溶液系統(tǒng)（即氯仿-甲醇-水），將各種脂質(zhì)一并提取出來，提取物再用氯仿和水稀釋，以形成二相系統(tǒng)，水溶性雜質(zhì)易分配進(jìn)入甲醇-水相，而脂質(zhì)進(jìn)入氯仿相把脂質(zhì)分離。
薄層層析（Thin--Layer-Chromatography縮寫TLC）是將作為固定相的支持劑涂于支持板上面進(jìn)行的一種層析技術(shù)。此法較相應(yīng)支持劑材料做成的柱層析、紙層析等有更多的優(yōu)越性。最突出的特點(diǎn)是操作簡便和層析速度快。缺點(diǎn)是對生物大分子分離效果欠佳。近年來，由于薄層板的不斷改進(jìn)，實(shí)施薄層層析的操作 儀器 化，已將一般的薄層層析發(fā)展成為高效薄層層析（HPTLC），可在幾分鐘內(nèi)將含有多至十余個(gè)組分的樣品分離開。各種規(guī)格的薄層預(yù)制版及專門 儀器 已趨向商品化。
制作薄層層析用的硅膠一般有兩類。一類是不加添加劑的稱硅膠H；另一類是添加了黏合劑（如石膏）稱硅膠G。有的為便于鑒定，還加入了特殊的熒光劑，常以字母F表示。不同類型的硅膠各有不同的用途。本實(shí)驗(yàn)是用硅膠H為支持劑，用薄層層析技術(shù)分離鑒定腦組織所含的脂質(zhì)。
[方法和步驟]
1、脂質(zhì)的提取
稱取新鮮豬腦1.5g，用剪刀剪碎，置于研缽內(nèi)磨成漿后，倒入勻漿管內(nèi)，冰浴中勻漿2min。向勻漿內(nèi)加入7.5mL抽提液Ⅰ，繼續(xù)勻漿2min。然后將勻漿液于2500 r/min離心10min。吸取上清液貯存于分液漏斗中，沉淀再加入9.5mL抽提液Ⅱ，攪拌成懸濁液后再勻漿2min，隨之離心10min。合并兩次上清液，加入氯仿和水各2.5mL，分液漏斗內(nèi)間歇搖振2min，然后靜置30min左右，提取液逐漸分成兩相（注意觀察分相過程）。上相為甲醇-水相，下相為含脂質(zhì)混合物的氯仿相，從漏斗分流出氯仿相，置冰箱內(nèi)備用。
2、脂質(zhì)的分離鑒定（薄層層析法TLC）
（1）硅膠H薄層的制備
將經(jīng)95%乙醇擦凈過的3mm×35mm×100mm層析玻璃置于水平臺上，然后稱取精制硅膠H 3.0g置于25mL:燒杯內(nèi)，加入0.1%碳酸氫鈉約8mL，調(diào)成具有一定愁度和流動性的膠漿。用10mL量筒量取漿液3mL，迅速小心流鋪在層析板上（注意板面厚度均勻，切勿使?jié){液溢出板外），鋪畢后繼續(xù)水平靜置30min～1h，使硅膠充分沉固，薄層表面凝成膜狀。然后將層析板移入烘箱內(nèi)水平位置，40℃干燥至硅膠薄層發(fā)白。
（2）薄層活化
升高烘箱溫度，使薄層充分干燥，此過程稱為活化。為防止薄層表面起泡，應(yīng)首先于80℃左右烘20min左右，然后升溫至120℃再烘2h，活化畢小心取出置于干燥器內(nèi)冷卻至室溫。
（3）點(diǎn)樣
將活化的硅膠薄板從干燥器內(nèi)取出放妥后，立即在距底邊2～3cm處中央，用內(nèi)徑0.5mm點(diǎn)樣毛細(xì)管吸取脂質(zhì)混合液，分三次在同一點(diǎn)上點(diǎn)入薄層。點(diǎn)樣直徑不超過2～3mm，每點(diǎn)一次待近干后再點(diǎn)下一次（小心勿損壞薄層膠面）。
（4）平衡和展開
將潔凈層析缸一端墊起，使其傾斜成15 0 左右，然后沿低端的缸內(nèi)壁加入一定量的展開 試劑 。將點(diǎn)好樣的薄板小心安放在缸內(nèi)，近點(diǎn)樣的一頭擱在缸底高的無展開劑侵入的一端，另一端靠在缸內(nèi)壁或玻架上）。將薄板位置調(diào)整穩(wěn)妥后，加蓋封閉平衡約2h。
平衡結(jié)束后，仍保持層析缸封閉狀態(tài)，將缸底一端的展開劑傾斜流向另一端，層析板硅膠浸入展開劑中，展開開始。待展開劑上行至層析板上端1~1.5cm處，展開停止，開蓋取出薄板晾干。
（5）顯色
將展開晾干的薄板置于碘蒸氣缸內(nèi)熏蒸，30min后即漸見黃色斑點(diǎn)顯出，數(shù)小時(shí)后，斑點(diǎn)更明顯。展層結(jié)果通常出現(xiàn)5～6個(gè)分離斑點(diǎn)。描出實(shí)驗(yàn)圖譜。
北京天優(yōu)福康生物科技有限公司
官網(wǎng)：http://www.jyzjsd.com/
服務(wù)熱線：400-860-6160
聯(lián)系電話/微信：13718308763
QQ:2136615612 3317607072
E-mail：Tianyoubzwz@163.com
