生物大分子的離心分離實(shí)例
例（ 1 ）去蛋白的 RNA 分離：
（ i ） 樣品勻漿加入 9 倍容積的冰冷 20mM Tris-HCl （ PH8.0 ） 1mMEDTA 。
（ ii ） 加入 1/10 容積的 10% SDS ，再加入等容積的（苯酚：氯仿：異丙醇）（容積比 50 ： 50 ： 2 ）溶液并含有 0.1% 的 8- 羥基喹啉溶液充分混合使其乳化。
（ iii ） 以上溶液在 10,000xg 離心 10 分鐘。
（ iv ） 移出上清液，重復(fù)（ ii ）（ iii ）過程一次。
（ v ） 第二次離心后上清液中加入 1/10 容積的 3M 醋酸銨，充分混合后再加入二倍容積的乙醇，并在 -20 ℃ 靜置二小時(shí)以上。
（ vi ） 10,000xg 5 ℃ 離心10 分鐘得到 RNA 沉淀。
（ vii ） 用干燥的 N2 氣體蒸發(fā)掉沉淀中殘留的乙醇。
（ viii ） 將 RNA 溶于 20mMTris-HCl （ PH8.0 ）， 1mMEDTA 中， -20 ℃ 低溫保存待用。
例（ 2 ）從大腸桿菌中分離質(zhì)粒 DNA ：
（ i ） 溶液制備：
溶液 I ： 50mM 葡萄糖， 10mM （ EDTA ）， 25mM Tris-HCl （ PH8.0 ）
溶液 II ： 0.2M NaOH ， 1% SDS
溶液 III ： 3M 醋酸納（ PH4.8 ）
TE 緩沖液： 10mMTris-HCl （ PH7.4 ）， 2mM EDTA
（ ii ） E. Coli 培養(yǎng)液 1 升 （量大按比例配置）
（ iii ）將 1 升 培養(yǎng)液在 4,000rpm （約 2,000xg ）， 5 ℃ 離心 20 分鐘，得到細(xì)菌沉淀。
（ iv ）用 100ml 冰冷的溶液 I “洗”沉淀，再次離心， 4,000rpm ， 5 ℃ ， 20 分。
（ v ）用 20ml 冰冷溶液 I 將第二次離心沉淀調(diào)成均勻懸浮液。
（ vi ）每 ml 懸浮液加入 2mg 溶菌酶，并在 0 ℃ 冰浴中放置 10 分鐘。
（ vii ）加入 40ml 溶液 II ，輕輕攪拌后，在冰浴中放置 5 分鐘。
（ viii ）加入 30ml 溶液 III ，在冰浴中放置 20 分鐘，使蛋白質(zhì)大部分沉降。
（ ix ）在高速冷凍離心機(jī)上用角式轉(zhuǎn)頭， 10,000rpm （約 10,000xg ）離心 15 分鐘， 5 ℃ 。
（ x ）小心地倒去上清（不擾動(dòng)沉淀），在沉淀中加入 55ml 異丙醇，即得到粗制的質(zhì)粒 DNA 溶液。
（ xi ）粗制 DNA 液在 -20 ℃ 靜置 15 分鐘以上，再在 12,000rpm （約 15,000xg ） 4 ℃ 離心 5 分鐘，倒去上清液。
（ xii ）真空中抽去異丙醇，沉淀中加入 18ml 經(jīng)過消毒的 TE 緩沖液，在沉淀溶解后再加入 0.65ml ， 1% E.B.
（ xiii ）以上溶液每 ml 加入分析純 CsCl 1 克 ，使其完全溶解，檢測(cè)溶液折射率應(yīng)為1.3890 （密度≈ 1.587 ）
（ xiv ）用以上溶液按照參考文獻(xiàn)（ 6 ）所介紹的方法作質(zhì)粒 DNA 分離。
（ xv ）離心后在 300nm 紫外光下可顯示 DNA 帶（線性 DNA 帶和質(zhì)粒 DNA 帶， RNA 沉淀在底部，蛋白質(zhì)浮在液面）。
（ xvi ）用文獻(xiàn)（ 1 ）介紹的方法取出質(zhì)粒 DNA ，抽提去掉 E.B. 透析法或脫鹽柱去除 CsCl 。
例（ 3 ）用 CsCl 梯度分離 DNA 并測(cè)定其組成（ % G+C ）
（ i ） CsCl 溶液密度 D 與溶液中 CsCl 的重量百分比濃度 P 之間的關(guān)系： D=138.11/ （ 137.48-P ）
（ ii ） 制備初密度為 1.706 克 / 毫升的梯度液，應(yīng)按以下要求配置
4.85 克 CsCl （分析純）
50 μ l ， 1.0M Tris-HCl （ PH7.4 ）
20 μ l ， 0.2M EDTA （ PH7.4 ）
0.5ml DNA 樣品
3.3ml 重蒸水
（ iii ） 用光折射儀檢測(cè) CsCl 的初始密度 D ，設(shè)測(cè)得的光折射率為 RI ，則有 D=10.8601 × RI-13.4974
（ iv ） 測(cè)得的 RI 應(yīng)為 1.4000 ，如果檢測(cè)值大于此值，再加重蒸水容量為 V （毫升），梯度液的總?cè)萘繛?G （毫升）， V=1.52 × G ×（ D 測(cè)定 -D 需要），如果檢測(cè)值小于 1.4000 ，那么再加固態(tài) CsCl （ W ）克
W=1.32 × G ×（ D 需要 -D 測(cè)定）
（ v ） 再測(cè)溶液折射率直至調(diào)整 RI=1.4000
（ vi ） 將配置好的液體充滿于 5ml 的一次性快速密封離心管，并利用封口機(jī)密封。
（ vii ） 固定角式轉(zhuǎn)頭 150,000xg ， 20 ℃ 離心 50~55 小時(shí)（約 35,000rpm ）或垂直管轉(zhuǎn)頭 300,000xg ， 20 ℃ 離心 12 小時(shí)（約 55,000rpm ）
（ viii ） 離心后利用梯度儀或手工收集成 50 管（每管 100 μ l ）。
（ ix ） 對(duì)每管樣品測(cè)定折射率至小數(shù) 4 位，測(cè)試過程中應(yīng)保持樣品溫度為 20 ℃ ，根據(jù)折射率 RI 計(jì)算各管樣品的密度 D 。
（ x ） 每管中加 1 毫升重蒸水，在 260nm 波長(zhǎng)時(shí)分別測(cè)各管光密度（ OD ），如果 DNA 已做了同位素標(biāo)記，那么還要對(duì)收集的樣品分別做液體閃爍計(jì)數(shù)儀測(cè)定輻射值。
（ xi ） 以離心管容量為橫坐標(biāo)（從管底至管面），分別以各管測(cè)得的 OD 值或同位素放射計(jì)數(shù)值為縱坐標(biāo)作曲線。找到曲線的峰值位置即可做 DNA 定位。
（ xii ） 用下式計(jì)算 DNA 組成：
% （ G+C ） = （ D-1.66 ） /0.098 × 100
如果能在離心樣品中加入標(biāo)準(zhǔn) DNA ，計(jì)算就更加準(zhǔn)確。
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