蛋白質濃度測定——Folin-酚試劑法
[原理]
實驗室常規測定蛋白質含量方法中，以Lorry等人發展的Folin-酚試劑法應用最為普遍。該方法的優點是：靈敏度高，較紫外吸收法靈敏10～20倍，雙縮脲法靈敏100倍；操作簡單快速，不需要復雜的 儀器 設備。但它的不足之處是反應過程中受干擾因素較多。
Folin-酚 試劑 由 試劑 A和試劑B兩部分組成。在Folin-酚試劑法中，蛋白質中的肽鍵首先在堿性條件下與酒石酸鉀鈉-銅鹽溶液（試劑A）起作用生成紫色絡合物（類似雙縮脲反應）。
由于蛋白質中酪氨酸、色氨酸的存在，該絡合物在堿性條件下進而與試劑B（磷鉬酸和磷鎢酸、硫酸、溴等組成）形成藍色復合物，其呈色反應顏色深淺與蛋白質含量成正比。
通過比色測定，參照已知含量的標準蛋白質的標準曲線，可確定待測樣品的蛋白質含量。本法可測定蛋白質含量的范圍在25～250μg/mL。
由于不同蛋白質所含酪氨酸和色氨酸殘基的量不同，致使等量的不同蛋白質所顯示的顏色深度不盡一致，產生誤差。如果所用溶液或樣品中含有帶“-CO-NH2”、“-CH2-NH2” 、“-CS-NH2”基團的化合物，或者溶液或樣品中含有氨基酸、Tris、核酸、蔗糖、硫酸銨、巰基及酚類等化合物時，會給本方法的測定帶來干擾。
磷鉬酸-磷鎢酸試劑（Folin-酚試劑B）僅在酸性條件下穩定，而蛋白質的顯色反應需在pH10的環境中進行，因此當試劑B加入后應當立即充分混勻，以便在磷鉬酸-磷鎢酸試劑被破壞之前與蛋白質發生顯色反應，這對于結果的重現性非常重要。
[方法與步驟]
1、標準曲線的繪制
取六支 試管 ，標明編號（0～5），放置在 試管 架上，在試管內分別加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL標準酪蛋白溶液，用 蒸餾 水補足至每管總體積1.0mL。再加入新配制的試劑A 5.0mL，充分混合，在室溫下放置10min。各管中加入0.5mL試劑B，立即搖勻，然后在室溫下放置30min。以零號管作空白對照，在660nm波長下比色測定。
以標準蛋白毫克數為橫坐標，A660值為縱坐標繪制標準曲線。
2、未知蛋白濃度的測定
方法與步驟與上述第5管相同，用1.0mL未知濃度蛋白溶液代替標準蛋白溶液。未知濃度蛋白測定應與標準曲線制作過程同步進行。
根據未知濃度蛋白溶液的A660值，運用標準曲線圖，查得所對應的蛋白毫克數，計算蛋白溶液的濃度（μg/mL）。實驗（五） 考馬斯亮藍G-250法測定蛋白質含量
[原理]
考馬斯亮藍G-250存在著兩種不同的顏色形式，紅色和藍色。考馬斯亮藍G-250在酸性游離狀態下呈棕紅色，最大光吸收在465nm，當它與蛋白質結合后變為藍色，最大光吸收 在595nm。在一定的蛋白質濃度范圍內，蛋白質-染料復合物在波長為595nm處的光吸收與蛋白質含量成正比，通過測定595nm處光吸收的增加量可知與其結合蛋白質的量。
蛋白質和考馬斯亮藍G-250結合，在2min左右的時間內達到平衡，完成反應十分迅速，其結合物在室溫下1小時內保持穩定。蛋白質-染料復合物具有很高的消光系數，使得在測定蛋白質濃度時靈敏度很高，可測微克級蛋白質含量。
[方法與步驟]
1、標準曲線繪制
取6支試管，按下表加入各試劑。
管號 試劑 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
100μg/ml牛血清白蛋白溶液／mL | 0 | 0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.8 | 1.0 |
蒸餾 水／mL | 1.0 | 0.8 | 0.6 | 0.4 | 0.2 | 0 |
考馬斯亮藍液／mL | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 |
加入考馬斯亮藍G-250蛋白試劑后，搖勻，放置2min后，在595nm波長下比色測定，記錄A 595 。
以各管相應標準蛋白質含量（mg）為橫坐標、A 595 為縱坐標，繪制標準曲線。
2、樣品測定
試管 中加自制蛋白質樣品1.0mL ，再加入5.0mL考馬斯亮藍G-250試劑，搖勻，放置5min后，在595nm波長下比色，記錄A 595 。
根據所測A 595 從標準曲線上查得蛋白質含量。
注意事項
（1） 如果測定要求很嚴格，可以在試劑加入后的5～20min內測定光吸收，因為在這段時間內顏色是最穩定的。比色反應需在1h內完成。
（2） 測定中，蛋白-染料復合物會有少部分吸附于 比色杯 壁上，實驗證明此復合物的吸附量是可以忽略的。測定完后可用乙醇將藍色的 比色杯 洗干凈。
考馬斯亮藍法測定蛋白質濃度，是利用蛋白質-染料結合的原理，定量的測定微量蛋白濃度的快速、靈敏的方法。
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