重組質(zhì)粒
質(zhì)粒具有穩(wěn)定可靠和操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)。如果要克隆較小的DNA片段(＜10kb)且結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,質(zhì)粒要比其它任何載體都要好。在質(zhì)粒載體上進(jìn)行克隆,從原理上說(shuō)是很簡(jiǎn)單的，先用限制性?xún)?nèi)切酶切割質(zhì)粒DNA和目的DNA片段, 然后體外使兩者相連接, 再用所得到重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌,即可完成。但在實(shí)際工作中, 如何區(qū)分插入有外源DNA的重組質(zhì)粒和無(wú)插入而自身環(huán)化的載體分子是較為困難的。通過(guò)調(diào)整連接反應(yīng)中外源DNA片段和載體DNA的濃度比例,可以將載體的自身環(huán)化限制在一定程度之下,也可以進(jìn)一步采取一些特殊的克隆策略,如載體去磷酸化等來(lái)最大限度的降低載體的自身環(huán)化,還可以利用遺傳學(xué)手段如α互補(bǔ)現(xiàn)象等來(lái)鑒別重組子和非重組子。
外源DNA片段和質(zhì)粒載體的連接反應(yīng)策略有以下幾種：
1、帶有非互補(bǔ)突出端的片段 用兩種不同的限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行消化可以產(chǎn)生帶有非互補(bǔ)的粘性末端,這也是最容易克隆的DNA片段，一般情況下,常用質(zhì)粒載體均帶有多個(gè)不同限制酶的識(shí)別序列組成的多克隆位點(diǎn)，因而幾乎總能找到與外源DNA片段末端匹配的限制酶切位點(diǎn)的載體，從而將外源片段定向地克隆到載體上。也可在PCR擴(kuò)增時(shí)，在DNA片段兩端人為加上不同酶切位點(diǎn)以便與載體相連。
2、帶有相同的粘性末端 用相同的酶或同尾酶處理可得到這樣的末端。 由于質(zhì)粒載體也必須用同一種酶消化，亦得到同樣的兩個(gè)相同粘性末端，因此在連接反應(yīng)中外源片段和質(zhì)粒載體DNA均可能發(fā)生自身環(huán)化或幾個(gè)分子串連形成寡聚物, 而且正反兩種連接方向都可能有。所以，必須仔細(xì)調(diào)整連接反應(yīng)中兩種DNA的濃度, 以便使正確的連接產(chǎn)物的數(shù)量達(dá)到最高水平。還可將載體DNA的5'磷酸基團(tuán)用堿性磷酸酯酶去掉, 最大限度地抑制質(zhì)粒DNA的自身環(huán)化。帶5'端磷酸的外源DNA片段可以有效地與去磷酸化的載體相連, 產(chǎn)生一個(gè)帶有兩個(gè)缺口的開(kāi)環(huán)分子,在轉(zhuǎn)入E. coli受體菌后的擴(kuò)增過(guò)程中缺口可自動(dòng)修復(fù)。
3、帶有平末端 是由產(chǎn)生平末端的限制酶或核酸外切酶消化產(chǎn)生，或由DNA聚合酶補(bǔ)平所致。由于平端的連接效率比粘性末端要低得多，故在其連接反應(yīng)中，T4 DNA連接酶的濃度和外源DNA及載體DNA濃度均要高得多。通常還需加入低濃度的聚乙二醇(PEG 8000)以促進(jìn)DNA分子凝聚成聚集體的物質(zhì)以提高轉(zhuǎn)化效率。
特殊情況下，外源DNA分子的末端與所用的載體末端無(wú)法相互匹配,則可以在線(xiàn)狀質(zhì)粒載體末端或外源DNA片段末端接上合適的接頭(linker)或銜接頭(adapter)使其匹配, 也可以有控制的使用E. coli DNA聚合酶Ⅰ的klenow大片段部分填平3'凹端,使不相匹配的末端轉(zhuǎn)變?yōu)榛パa(bǔ)末端或轉(zhuǎn)為平末端后再進(jìn)行連接。
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